论文部分内容阅读
背景：腹膜透析是终末期肾脏病重要替代疗法之一，得到了越来越广泛的应用。但腹膜透析相关性腹膜炎及腹膜纤维化的发生给腹膜透析的发展带来了很大的阻力，成为CAPD患者退出腹膜透析治疗的主要原因之一。含葡萄糖非生理性腹透液、低PH值(5.2)、反复发生的腹膜炎及尿毒症毒素是导致腹膜结构和功能受损的主要因素，最终导致腹膜纤维化和腹膜功能的减退（超滤衰竭），它是腹膜透析失败和退出腹膜透析的主要原因。革兰氏阴性菌感染所致腹透相关性腹膜炎的发生日益增加，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌的外膜成分。尽管以葡萄糖作为溶质的腹透液存在诸多生理不相容性，但目前世界范围仍以其作为主要的透析溶质，因此，本实验拟采用高糖及脂多糖刺激腹膜间皮细胞，观察致纤维化相关指标的变化及意义。
整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与整合素β1，β3亚单位结合，介导细胞外基质和生长因子信号向胞内传递，为PI3-K的作用靶点之一，并调控PKβ/AKT及GSK-3β的活性，调节细胞的生长、存活、细胞周期、转分化、凋亡、侵袭、移行以及肿瘤血管的发生。整合素连接激酶参与肾脏，肝脏和肺等的纤维化过程。研究证明ILK是TGF-β1诱导肾小管EMT的中心环节，TGF-β1通过Smad信号途径诱导肾小管上皮细胞特异性表达ILK。对糖尿病肾病的研究发现，肾小球足细胞及系膜细胞在高糖刺激后ILK表达升高，参与足细胞与系膜细胞的EMT。而对大鼠腹膜间皮细胞整合素连接激酶的表达情况尚未检索到相关文献。
水飞蓟素是从水飞蓟植物提取的混合物，是一种黄酮醇类化合物，主要含水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟醇等，是一种重要的的中草药保肝药物。水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性成分，水飞蓟素具有多种药理活性，例如抗炎症，抗纤维化，抗病毒，免疫调节等。
目的：探讨高糖及LPS对大鼠腹膜间皮细胞ILK，TGF-β1，CTGF及α-SMA表达的影响和水飞蓟宾的可能作用机制，进而为防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供一定的思路。
方法：
（一）原代细胞培养取清洁级SD雄性大鼠大网膜，进行原代细胞培养。
（二）检测方法胰蛋白酶消化法分离培养RPMCs，Real-time-RT-PCR法检测ILK及α-SMAmRNA的表达。Western Blot检测ILK蛋白的表达。ELISA法检测TGF-β1及CTGF的蛋白表达。
（三）实验分组1.正常对照组;只加1％胎牛血清的DMEM/F12培养基2.葡萄糖组;(1)不同浓度葡萄糖(1.5％，2.5％，4.25％)分别作用24h;(2)2.5％高糖分别作用12，24，48，72h3.脂多糖组;(1)不同浓度脂多糖(1，10，100ug/ml)分别作用24h;(2)10ug/ml脂多糖分别作用12，24，48，72h4.水飞蓟宾组;水飞蓟宾(5，10，20ug/ml)分别预孵育2小时，各加入2.5％高糖培养基或10ug/ml LPS培养基再孵育24h;
结果：
（一）高糖对RPMCs的ILK、α-SMA表达的影响1.5％葡萄糖可使RPMCs的ILK、α-SMA mRNA表达增加(P＜0.05)，4.25％葡萄糖作用最强(P＜0.05）;2.5％葡萄糖作用12小时RPMCs的ILK mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05），24小时ILK mRNA和蛋白表达最高(P＜0.05);2.5％葡萄糖作用12小时RPMCs上调α-SMA mRNA的表达，成时间依赖性(P＜0.05）;水飞蓟宾可降低高糖引起的RPMCs中ILK、Ⅱ-SMA的表达，呈剂量依赖性（P＜0.05）。
（二）高糖对RPMCs的TGF-β1及CTGF表达的影响高糖组上清液中TGF-β1及CTGF含量显著高于对照组（P＜0.01）;高糖成时间和剂量依赖性上调TGF-β1及CTGF的表达（P＜0.01）。水飞蓟宾可降低高糖引起的RPMCs中TGF-β1及CTGF的表达，呈剂量依赖性（P＜0.01）。
（三）LPS对RPMCs的ILK、α-SMA表达的影响1μg/ml LPS可使RPMCs的ILK、α-SMA mRNA表达增加(P＜0.05)，100μg/mlLPS作用最强(P＜0.05);10μg/ml LPS作用12小时ILK的mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05)，24小时ILK mRNA和蛋白表达最高（P＜0.05）。水飞蓟宾可降低LPS引起的RPMCs中ILK、α-SMA的表达，呈剂量依赖性（P＜0.05）。
（四）LPS对RPMCs的TGF-β1及CTGF表达的影响LPS组上清液中TGF-β1及CTGF含量显著高于对照组(P＜0.01);LPS成时间和剂量依赖性上调TGF-β1及CTGF的表达（P＜0.01）。水飞蓟宾可降低LPS引起的RPMCs中TGF-β1及CTGF的表达，呈剂量依赖性（P＜0.01）
结论：
（一）大鼠腹膜间皮细胞存在ILK的表达。
（二）高糖和脂多糖可以从基因和蛋白水平以浓度和时间依赖方式上调体外培养的RPMCs的ILK的表达，同时以浓度和时间依赖方式刺激TGF-β1，CTGF及α-SMA的表达。
（三）水飞蓟宾可以从基因和蛋白水平抑制高糖及脂多糖对ILK的表达上调作用，同时抑制TGF-β1，CTGF及Ⅱ-SMA的产生。