目的：　　 乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)是乙型肝炎病毒(HBV)编码的小分子蛋白质，在肝细胞癌(HCC)的发生发展中起重要作用，影响着肝癌细胞的生物学特性，可致肝癌的发生，但具体机制不清。表观遗传修饰异常在肝癌进展中具有重要作用，组蛋白异常修饰是其中之一。SET及MYND结构域包含蛋白3(SMYD3)是新近发现的一种组蛋白甲基转移酶，参与组蛋白甲基化修饰，且在肝癌组织中高表达，但其表达调控的具体机制不清。本课题旨在研究HBx在乙肝相关性肝细胞癌中的表达情况及临床意义，明确HBx与SMYD3的关系，以及HBx调控SMYD3表达的具体生物学机制，从“HBx-SMYD3-表观遗传异常修饰”这一全新途径阐明HBV相关性肝细胞癌发生的可能机制。　　 方法：　　 1.用免疫组织化学法检测41例乙肝相关性肝癌患者肿瘤组织中HBx蛋白的表达情况，与患者的临床资料(HBV的感染状态、肿瘤病理分级、无病生存期)进行相关分析，并应逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)、多聚酶链反应(PCR)及Western blot法检测肝癌患者肿瘤组织及血清中HBx的表达情况，对比各种方法HBx的检出情况。　　 2.同时应用免疫组织化学法检测上述患者相邻肿瘤组织中SMYD3蛋白的表达情况，将HBx与SMYD3的表达情况进行相关性分析，并应用RNA干扰技术沉默HBx的表达后检测SMYD3的表达情况及细胞组蛋白甲基转移酶(H3-K4)活性的变化，应用基因转染技术瞬时上调HBx的表达后再检测SMYD3表达的情况及细胞组蛋白甲基转移酶(H3-K4)活性的变化，明确HBx与SMYD3的关系。　　 3.进一步应用染色质免疫沉淀、免疫共沉淀、DNA-蛋白质沉淀技术筛选出HBx作用于SMYD3基因调控区域的片段，明确HBx与RNA多聚酶Ⅱ的相互作用，对比HBx阳性与阴性肿瘤细胞中HBx及RNA多聚酶Ⅱ对SMYD3基因调控区域作用位点的变化情况，应用双荧光素酶报告实验筛选出HBx作用的片段中可能存在的HBx的顺作用元件，明确HBx调控SMYD3表达的具体机制。　　 结果：　　 1.肝癌组织中HBx蛋白质的总体阳性检出率为27/41(65.85％)，其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)或乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性者HBx的阳性率为20/25(80.00％)，而HBsAg及HBeAg均为阴性者HBx的阳性率为7/16(43.75％)；HBx阳性与HBx阴性者肿瘤组织低分化比例分别为11/27(40.74％)及2/14(14.29％)，差异有统计学意义(p＜0.01)，且肿瘤组织低分化比例随HBx阳性表达程度的增加而增加，HBx强阳性表达者肿瘤组织低分化比例高达4/6(66.67％)；RT-PCR对肝癌肿瘤组织HBx信使RNA(mRNA)的检出率为10/16(62.50％)，PCR对肝癌患者血清中的HBx拷贝的检出率为1/7(14.29％)，而Western blot对肝癌患者血清中的HBx蛋白的检出率则高达6/7(85.71％)；对HBx阳性及阴性肝癌患者进行Kaplan-Meier生存分析，并用Log-rank检验两组病例无病生存期(DFS)的差异，结果提示：HBx阳性组的无病生存期(DFS)明显短于HBx阴性组(p=0.032)。　　 2.SMYD3在肝癌组织中的总体阳性表达率为19/41(46.34％)，HBx阳性表达的肝癌组织中SMYD3的阳性率为19/27(70.37％)，而HBx阴性表达的肝癌组织中则检测不到SMYD3的表达，x2检验提示两者的表达呈明显的正相关(p＜0.05，r=0.45)；RNA干扰沉默HBx的表达可以在mRNA及蛋白质水平明显减低SMYD3的表达并显著抑制细胞总体组蛋白甲基转移酶(H3-K4)活性(p＜0.01)；而HBx转基因瞬时上调HBx的表达可以在mRNA及蛋白质水平明显上调SMYD3的表达并显著增强细胞总体组蛋白甲基转移酶(H3-K4)活性(p＜0.05)。　　 3.染色质免疫沉淀显示HBx作用于SMYD3基因上游近端序列(SD2)而不是远端启动子(SD6)，且RNA多聚酶Ⅱ也作用于该序列，HBx可与RNA多聚酶Ⅱ相互作用；在SMYD3阳性肿瘤细胞中，HBx存在时RNA多聚酶Ⅱ作用于SD2段，而当HBx缺失时RNA多聚酶Ⅱ则作用于远端启动子SD6段；双荧光素酶报告实验结果显示SD2段包含有一个HBx的顺式作用元件，该顺式作用元件位于SMYD3基因上游-178bp到-203bp处，当该顺式作用元件存在时，HBx可以明显增强启动子质粒的荧光素酶活性(p＜0.05)，当该顺式作用元件缺失时，HBx的作用消失(p＞0.05)。　　 结论：　　 1.肝癌患者肿瘤组织及血清中均可以检测到HBx的表达，且肝癌肿瘤组织中HBx的表达与肿瘤的病理分级呈负相关，肿瘤组织低分化比例随HBx阳性表达程度的增加而增加，肝癌组织中HBx的表达导致了肝癌组织较差的肿瘤病理分级及肝癌患者较短的无病生存期；从肝癌患者血清中能有效且简便地检测出HBx蛋白的表达，可以作为一种简便的、可行的监测HBx的方法；部分HBsAg及HBeAg均为阴性的肝癌患者中仍能检测到HBx的表达，肝癌患者的抗HBV治疗应该扩大到HBx阳性表达的病例，或者应该引入抗HBx治疗。　　 2.HBx与SMYD3的表达呈明显的正相关，HBx对SMYD3的表达起明确的调控作用，并相应地影响细胞组蛋白甲基转移酶(H3-K4)的活性，HBx是SMYD3表达的上游调控因素。　　 3.HBx通过募集RNA多聚酶Ⅱ到SMYD3基因上游近端启动子区中新发现的HBx的顺式作用元件进而上调SMYD3的表达并增强细胞组蛋白甲基转移酶活性，而且改变了SMYD3在肿瘤细胞中的转录模式。　　 本课题通过研究HBx在乙肝相关性肝细胞癌中的表达情况及临床意义，明确了HBx与SMYD3的关系，以及HBx调控SMYD3表达的具体生物学机制，初步阐明了“HBx-SMYD3-表观遗传异常修饰”这一新的途径在乙肝相关性肝细胞癌发生中的作用，较深入的探讨了乙肝相关性肝细胞癌发生的表观遗传学机制，为乙肝相关性肝细胞癌的防治提供可靠的理论依据及新的治疗靶点。