本文研究内容及目的，拟进行以下实验：利用BrdU标记舌背上皮细胞，研究其在舌背粘膜及味蕾的动态分布，揭示味蕾细胞迁移特点及味蕾外周上皮在味蕾细胞更新中的作用，为味蕾细胞分化研究奠定基础。建立舌背上皮细胞分离、培养方法。在此基础上，将舌背上皮细胞与神经元细胞共培养，期望舌背上皮细胞与神经元细胞建立连接关系，模拟体内神经支配情况，观察在此培养体系中两种细胞生长特性，并检测舌背上皮细胞CK8的表达情况，探讨舌背上皮细胞转分化形成味蕾细胞的可行性 第一部分：BrdU标记SD大鼠舌背上皮细胞的实验研究。 研究材料与方法：36只2周龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为空白对照组(8只)和实验组(28只)；空白对照组内注射生理盐水，实验组腹腔内注射BrdU(3mg/kg)，分别于给药后2h、1d、3d、5d、8d、11d、14d过量注射戍巴比妥处死3只实验组及1只空白对照组动物；给药后8h，处死7只实验组及1只空白对照组动物。切取舌体前份1/3，浸泡入10％的中性福尔马林溶液，固定24小时以上，石蜡包埋，4μm连续切片，BrdU单抗免疫组织化学检测。 研究结果 2.1舌背黏膜的BrdU阳性细胞舌背粘膜都能发现BrdU阳性细胞，开始时位于上皮的基底细胞层，随时间推移，棘层、颗粒层、角化层上皮内逐渐出现BrdU阳性细胞。在给药1周后，上皮内BrdU阳性细胞明显减少；两周后，上皮基本上己检测不到阳性细胞，只在基底层内偶有散在的阳性细胞。 2.2味蕾内BrdU阳性细胞随时间推移，味蕾内BrdU阳性细胞逐渐增多，并从味蕾外周向中间迁移。 2.3味蕾与外周上皮的关系在给药8h后，味蕾外周上皮细胞(STBEC)的BrdU阳性率较味蕾内高，差异有显著性(P＜0.05)。周边的味蕾细胞呈BrdU阳性者，其邻近的STBEC有较高的阳性率(75％)，提示周边的味蕾细胞可能由STBEC增殖分化形成。 研究结论：味蕾由处于各种不同分化阶段的味蕾细胞组成；味蕾细胞可能来源于味蕾外周的舌背粘膜基底层细胞。 第二部分：舌背上皮细胞与神经元细胞共培养及CK8表达检测。 研究材料与方法： 1.1舌背上皮细胞的培养及鉴定断颈处死出生后1天的SD大鼠，70％乙醇浸泡3-5min，切取舌体及下颌。D-Hanks冲洗血迹，2.5g/L洗必泰浸泡5-8分钟，双倍浓度的双抗及两性霉素冲洗3-4次。置入盛有平衡液的三角烧杯内，于粘膜下注射胶原酶(1mg/ml)，直至舌体发生肿胀，粘膜变白。37℃恒温水浴箱内，胶原酶(0.2mg/ml)消化1h。剥离舌背粘膜，刮除粘膜下层残留的上皮细胞并收集。制备细胞悬液并以浓度为1x105/ml接种于培养瓶，移入37℃、含5％CO2培养箱中培养，每隔2天换液1次。倒置显微镜下观察各代细胞形态、生长和增殖情况。当细胞铺满整个培养瓶底70％时，进行细胞传代。采用细胞免疫化学染色法及透射电镜观察法对上皮细胞鉴定。 1.2神经元细胞的培养及鉴定断颈处死新生1天的SD大鼠，无菌条件下取大脑皮质，置入Krebs解剖液，解剖显微镜下剥除脑膜后剪成0.5mm3小块，平衡液洗涤3次，收集组织块，胰酶消化，制备细胞悬液并以浓度为2.5×105/ml接种于L-多聚赖氨酸包被的培养底，移入37℃、含5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，每隔2天换液1次。采用细胞免疫化学染色法对细胞进行鉴定。 1.3舌背上皮细胞与神经元细胞共培养将制备好的神经元细胞悬液5x105/ml与上皮细胞悬液2x105/ml混均(V∶V为1∶1)，接种于培养瓶接种于L-多聚赖氨酸包被的培养瓶底，置于37℃、含5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，每隔2天换液1次。 1.4舌背上皮细胞CK8表达检测采用细胞免疫化学法对共培养的上皮细胞CK8表达情况进行检测。 研究结果： 2.1舌背上皮细胞的培养接种时，原代细胞形状大小不等，呈多样性，表现为多角状扁平细胞、体积较大的球形细胞和体积较小的球形细胞。大多数细胞在培养24小时后贴壁；在培养3天后，细胞增殖形成许多小而不规则的细胞克隆或集落，开始进入指数增殖阶段，形成细胞团块。随着时间推移，细胞团块周围结构疏松，间隙增大，细胞团块不断增大，融合、连接成片，排列成铺路石状，可传3-4代。 2.2神经元细胞的培养神经元细胞与上皮细胞共培养1天后，神经元细胞大部分贴壁，胞体饱满，多呈纺锤状，胞质透亮，胞体内伸出小突起，生长状态良好，部分神经元细胞聚集成簇。培养5天后，神经元细胞的胞体增大，呈圆形或椭圆形，胞体周围的突起充分伸展并延长，形成单级或多极突起，轴突间相互交联，形成网状结构。培养10天后，大部分神经元细胞已裂解。 2.3舌背上皮细胞与神经元细胞共培养共培养早期，其生长特性与单独培养相类似。培养5天后，上皮细胞增殖形成细胞群落，神经元细胞部分死亡。镜下可见上皮细胞中心或周围者存在神经元细胞。 2.4舌背上皮细胞CK8表达情况CK8细胞免疫化学法检测发现，在本实验条件下，舌背上皮细胞呈CK8阴性表达。 研究结论： 3.1以DMEM/F12为基础培养基，可成功地培养出舌背上皮细胞。 3.2神经元细胞可以与舌背上皮细胞共培养。 3.3本实验条件下，舌背上皮细胞并没有转分化形成味蕾细胞。