研究背景和意义:足部溃疡创面经久不愈是糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者容易罹患的严重并发症之一,这种以周围神经损害及缺血为特征的足部溃烂,临床上称之为糖尿病足。研究显示糖尿病人群中并发糖尿病足的患者比例从15%到20%不等,这其中大约20%的患者需要接受截肢治疗[1],而截肢对患者来说是心理和生理的双重打击。糖尿病溃疡创面延迟愈合涉及多种复杂机制,目前关于糖尿病足部溃疡的病理研究主要集中在微生物侵袭、再上皮化障碍、持续的炎症反应和免疫功能受损等一些致病因素上[2,3]。而血运障碍是伴随所有糖尿病溃疡形成的另一个潜在致病因素,血运障碍会严重影响创面的正常愈合,多项研究强调了充分的血运和血管生成在组织修复中的重要性,并认为局部血管生成障碍和血供减少是糖尿病慢性创面愈合延迟的重要病理改变之一[4-6]。因此,加强创面血管生成反应的治疗策略可能可以有效地促进糖尿病慢性创面的愈合。血管生成是一个由内皮细胞（endothelial cells,ECs）、与其相关的血管周围支持细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）以及免疫细胞协调参与的动态过程。血管生成失调已被认为是多种疾病的共同病理改变,包括癌症、外周动脉疾病、糖尿病性血管病变、类风湿性关节炎和炎症性肠病等[7-10]。血管生成受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的微妙和动态平衡关系的调节。多种类型的细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板、免疫细胞和干/祖细胞）可通过分泌相关生长因子参与这一过程,其中发挥主要作用的是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）[11]、转化生长因子α[12]、转化生长因子β[13]、肿瘤坏死因子α[14]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[15-17]和磷脂酶C-γ（phospholipase C gamma,PLCγ1）[18-20]等。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）具有分化、旁分泌及免疫调控等功能,被认为在血管生成的过程中起到重要作用[21]。此外,Shin等人的研究发现在糖尿病动物模型中内源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的功能受损、以及迁移到受损创面的细胞数量明显降低是导致创面难以愈合重要因素之一[22]。目前已发现MSCs通过促进血管生成加速创面愈合的几种机制,包括分泌促血管生成因子、向内皮细胞和（或）周细胞分化促进血管生成、募集内源性干/祖细胞、调控细胞外基质产生和重塑以及免疫抑制作用等[23]。近年来,外源性MSCs在多种疾病动物模型中的治疗效果,特别是在创伤和缺血性疾病的治疗上受到了广泛的关注[24-26]。多项动物实验研究表明,外源性MSCs的注射治疗可以通过促进创面基底血管生成来加速糖尿病等慢性创面的愈合[27,28]。但是,从组织中获取的原代MSCs,其细胞生物学功能在经过体外培养和增殖后大幅降低,导致治疗效果低于预期[29]。因此,亟待寻找一种方法来增强长期扩增培养BM-MSCs的修复功能,并通过动物实验进一步检测其对糖尿病创面的促愈合作用和安全性。c-Cbl（c-Casitas b-lineage lymphoma）是细胞中的一种原癌基因,属于Cbl家族的成员之一,其编码的蛋白被认为是一种E3泛素连接酶且包含特征性的环指（RING Finger,RNF）结构域,能够调控细胞膜表面受体介导的多种信号[30,31]。实验证实在肿瘤及视网膜血管新生的病理过程中,抑制c-Cbl可以增强VEGF诱导的内皮细胞增殖和血管生成,从而促进这一进程[19]。另外,研究还发现在糖尿病小鼠模型中,敲除c-Cbl基因可以改善高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[32]。这些结果提示,c-Cbl能够通过调控信号分子转导影响细胞的功能改变进而参与血管生成的过程,并且c-Cbl基因在糖尿病动物模型中也起到重要作用。然而,c-Cbl在BM-MSCs及其长期扩增培养后的功能变化中是否起到作用,起到何种作用,目前尚不清楚。因此,在本文中我们通过向SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）并以血糖值建模标准筛选Ⅰ型糖尿病大鼠,用于制作创面模型。通过体外实验研究c-Cbl在长期扩增培养的BM-MSCs功能改变中的作用,并在动物模型上观察经过调控的BM-MSCs对促进糖尿病创面愈合的作用。研究结果对MSCs在糖尿病等慢性创面治疗的应用上具有重要意义,并为改善MSCs在体外扩增培养后的功能降低提供理论依据。此外,探索c-Cbl对MSCs促血管生成功能的调控作用,可以更好的阐明MSCs的功能变化与血管生成的关系,具有一定参考价值。实验研究方法:1.体外扩增培养大鼠BM-MSCs,检测c-Cbl与蛋白激酶B（Akt）的活化水平及相互作用关系将购买的Sprague-Dawley（SD）大鼠BM-MSCs在体外进行扩增培养,通过蛋白免疫印迹（western blot,WB）法分别检测传第3代（passage 3,P3）、传第6代（passage6,P6）及传第10代（passage 10,P10）细胞中Y731c-Cbl/c-Cbl和S473-Akt/Akt的蛋白表达水平;并且在P10细胞中使用锁核酸修饰的反义寡核苷酸间隔物（locked nucleic acid modified antisense oligonucleotide gapmers,LNA Gapmers）抑制c-Cbl表达,再次检测S473-Akt/Akt的蛋白表达变化。2.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs旁分泌血管生成因子及迁移能力的影响通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分别定量P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 BM-MSCs在体外培养过程中分泌血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）及b FGF的水平,同时采用小管形成试验分别检测内皮细胞在各组细胞条件培养液中形成血管样结构的程度变化。另外,采用Transwell试验检测各组细胞的迁移功能。3.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs增殖及衰老的影响采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒分别对P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs进行染色,以检测衰老细胞的比率。采用CCK-8（cell counting kit-8）试验检测各组细胞分别在24、48、72及96小时的细胞增殖速率。4.构建糖尿病大鼠创面模型首先我们以65mg/kg剂量对SD大鼠进行腹腔注射STZ,诱导构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型。然后,以1.8cm的直径在大鼠背部制作对称的两处圆形皮肤全层创面。术后1天在创面周围注射BM-MSCs进行治疗干预。5.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射下调c-Cbl表达的P10 BM-MSCs（转染c-Cbl LNA Gapmers）、阴性对照P10 BM-MSCs（转染Scramble LNA Gapmers）及等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）,采用免疫组化的方法检测术后7天和14天创面组织中血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和VEGFA的表达,以判断创面血管生成情况。6.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射PBS、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs,在创面制造后0、3、7、14天拍照并计算创面愈合率。另外,收集术后14天创面组织制作石蜡切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和马松（Masson）染色,并统计病理评分。实验结果:1.体外长期扩增培养的BM-MSCs中,c-Cbl的磷酸化水平明显增加而Akt的磷酸化水平受到抑制,c-Cbl LNA Gapmer转染能够下调c-Cbl的蛋白表达水平,并且c-Cbl下调后,Akt的磷酸化水平得到提高,表明c-Cbl在一定程度上介导了体外长期扩增培养诱导的BM-MSCs的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/Akt信号抑制。2.体外长期扩增培养的BM-MSCs,其旁分泌血管生成因子和迁移能力受到抑制,而下调c-Cbl的表达可改善其旁分泌和迁移能力。3.体外长期扩增培养的BM-MSCs增殖能力降低并呈现较高的衰老率,而下调c-Cbl的表达可增强其增殖能力并在一定程度上降低衰老率,但并没有过度激活MSCs的增殖活性。4.成功构建了STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠,并在此基础上制作了糖尿病大鼠创面模型,模型构建的成功率高、稳定性强。5.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对促进糖尿病创面血管生成的治疗效果,与对照组相比,局部注射c-Cbl下调的BM-MSCs可以显著促进创面组织中VEGFA的早期表达,并最终促进糖尿病创面的血管生成。6.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的速率。另外,通过HE及Masson染色统计分析的组织病理评分显示,经c-Cbl下调的BM-MSCs治疗后,创面评分明显高于对照组。结论:1.下调c-Cbl的表达可以改善BM-MSCs长期扩增培养后的Akt磷酸化抑制及促血管生成相关功能降低,表明c-Cbl的表达水平与BM-MSCs的Akt信号和功能变化具有一定的相关性。2.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对糖尿病大鼠创面的促血管生成及促愈合的治疗效果。