合成生物学以系统生物学为基础,应用工程学标准化、模块化、系统化的设计理念,设计并创造元件(Parts)、装置(Devices)、以及模块(Motifs),并利用这些设计、创造的“合成生物学零件”对现有的生物系统(Systems)进行改造和优化,或者人工重新合成具有预设特定功能的生物系统,实现在医药、农业、环境领域的大规模生产和应用。白藜芦醇是一种存在于自然界的天然抗毒素,在植物受到胁迫时分泌产生,具有抗菌、抗病毒、保护心血管等作用。目前在工业上大量获取白藜芦醇的方法是对天然植物组织进行萃取后分离。这种传统获取白藜芦醇的方法效率较低,操作方法复杂,对环境造成严重的破坏,同时也消耗了大量自然植物资源。本论文以合成生物学的思想理念为基础,选择酿酒酵母作为底盘细胞,将植物中的天然产物白藜芦醇作为目标产物,把酿酒酵母W303-1A构建成为异源合成白藜芦醇的“细胞工厂”。本论文研究内容主要分为以下五个部分:(1)基于高效液相色谱的检测技术建立了发酵过程中的目标产物白藜芦醇和诱导剂半乳糖的检测方法,该方法具有较高的检测准确度和良好的检测重复性,为实验过程中关键发酵参数快速高效的检测奠定了基础;(2)将不同来源的白藜芦醇生物合成途径中的五个关键酶基因:来源于圆红酵母的苯丙氨酸解氨酶基因pal、来源于粘红酵母的酪氨酸解氨酶基因tal、来源于拟南芥的肉桂酸4-羟基羧化酶基因c4h和4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl1、来源于花生的白藜芦醇合酶基因sts按照酿酒酵母密码子的偏好性优化后进行全基因合成。在酿酒酵母W303-1A中分别设计构建PAL-C4H-4CL1-STS、TAL-4CL1-STS两条异源合成途径,得到三缺酿酒酵母工程菌和二缺酿酒酵母工程菌。摇瓶培养后得到白藜芦醇的产量分别为0.94 mg/L和4.72 mg/L,成功实现天然产物白藜芦醇在酿酒酵母中的异源生物合成,同时分别验证了两种人工预设途径生产白藜芦醇的效率。(3)对酵母工程菌的发酵条件进行初步的探索优化。采用固体补料的方式对发酵液中半乳糖的含量进行优化,分别使三缺酿酒酵母工程菌和二缺酿酒酵母工程菌的白藜芦醇产量在摇瓶水平提高至1.64倍和1.31倍。采用流加补料的方式对发酵液中半乳糖的含量进行优化,使培养过程中的半乳糖含量动态维持在相对稳定的水平,使三缺酿酒酵母工程菌的白藜芦醇产量进一步提高至2.09倍。同时对三缺酿酒酵母工程菌进行连续三批次发酵罐培养,最终收获了 4.84 mg/L的白藜芦醇,相比摇瓶培养产量提高至5.14倍。结论表明酿酒酵母工程菌发酵条件的优化确实能够在一定程度提高白藜芦醇的产量。(4)探究酵母体内三羧酸循环中的关键酶柠檬酸合酶CIT的部分敲除对异源合成途径的影响。利用CRISPR-Cas9技术对酵母染色体上的柠檬酸合酶基因cit1基因进行敲除,构建三缺酵母工程菌Acit1和二缺酵母工程菌Acit1。结果显示三缺酵母工程菌Acit1培养后的白藜芦醇产量达到1.47 mg/L,与初始产量相比提高至1.56倍;二缺酵母工程菌Acit1培养后的白藜芦醇产量达到6.09 mg/L,与初始产量相比提高至1.29倍。表明cit1基因的缺失会削弱酵母的三羧酸循环,使菌体的生长繁殖速率减慢。但同时会使前体物质丙二酰辅酶A更多的流入异源合成途径中,增加白藜芦醇的产量。(5)利用文库筛选来探究酵母内源基因对白藜芦醇合酶表达量的影响,利用Gibson组装法构建应用于文库筛选的工具酵母荧光菌株,将表达绿色荧光蛋白基因egfp与异源合成途径中的限速酶白藜芦醇合酶基因sts用一段柔性的linker相连接设计构建工具酵母荧光菌株。利用绿色荧光蛋白的荧光强度来表征白藜芦醇合酶的表达量,从而能够快速、便捷的筛选出白藜芦醇合酶活性高的酵母菌株。同时构建三缺荧光酵母菌株、阳性对照荧光酵母菌株作为实验对照,通过测定三种酵母荧光菌株的荧光表达量来确定文库筛选时的荧光基准值以及筛选所需的诱导时间,为后续的建库筛选工作提供了方便有效的检测手段。本研究利用合成生物学的思想理念,将异源天然白藜芦醇合成途径设计构建为两条线路分别导入酿酒酵母中,成功构建苯丙氨酸途径异源合成白藜芦醇的酵母工程菌和酪氨酸途径异源合成白藜芦醇的酵母工程菌。同时基于高效液相色谱技术建立了白藜芦醇、半乳糖的检测方法,评价了不同异源合成途径中两种酵母工程菌生产白藜芦醇的能力,为工业生物合成白藜芦醇奠定了基础。在此基础上对发酵条件进行初步的探索优化,通过补加半乳糖和苯丙氨酸、使白藜芦醇的产量进一步得到提高。接着利用CRISPR-Cas9的技术对三羧酸循环中的柠檬酸合酶基因cit1进行敲除,探究酵母体内三羧酸循环中的关键酶柠檬酸合酶CIT的部分敲除对异源合成途径的影响。最后,我们构建了应用于文库筛选的酵母工具菌株,为后续的建库筛选工作提供了方便有效的检测手段。本论文的研究对白藜芦醇以及类似的酚类化合物的生物合成具有普遍的借鉴意义。