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一、研究背景人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染不仅会损害免疫功能,还会导致神经元损伤和HIV相关的神经认知障碍(HAND),尽管高效抗逆转录病毒疗法(HAART)可有效降低中枢神经系统(CNS)的HIV负担,但轻度和中度HAND仍然普遍存在并影响患者生活质量,这种现象表明HAART未能提供针对HIV相关神经元损伤的有效保护,需要有效的神经保护剂。研究报道,神经炎症与gp120诱导的神经元损伤有关。白细胞介素-1β(IL-1β)是一种关键的促炎介质,可在接触gp120后引发CNS的炎症和破坏性反应。IL-1β是前体pro-IL-1β通过NLRP3炎症小体活化的半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)切割而蛋白水解成熟释放。gp120与NLRP3的关系及其诱导IL-1β产生和随后神经元损伤的确切机制尚不清楚。二、研究目的本文旨在探讨gp120-NLRP3-caspase-1-IL-1β通路引起神经系统损伤,及NLRP3抑制剂MCC950和caspase-1 抑制剂Z-Y-VAD-fmk可减弱IL-1β、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和环氧合酶-2(COX-2)等神经毒性因子和趋化因子的释放,降低神经损伤和改善神经认知障碍的作用和机制,为HAND发病机制提供理论基础和临床治疗靶点的选择提供新的研究方向。三、研究方法1、gp120转基因(Tg)小鼠模型鉴定与增殖gp120 Tg小鼠交配繁殖的3周龄小鼠,剪取小鼠尾巴组织提取DNA,PCR后,核酸琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选出gp120表达阳性小鼠,标记好出生日期,增殖至6-14月龄,用于后续实验。2、gp120处理小胶质细胞BV2和神经元细胞gp120浓度梯度和时间梯度处理BV2细胞或神经元细胞,以及使用NLRP3、caspase-1、K+、ROS、组织蛋白酶B、钾离子电压门控通道Kv1.3、CXCR4、IL-1受体等的抑制剂和/或相应的siRNA基因沉默技术处理细胞,收集细胞上清和细胞蛋白,酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白免疫印迹(westemblot,WB)和免疫荧光观察检测gp120诱导的IL-1β、NLRP3、caspase-1、ASC寡聚化、神经毒性因子等的表达水平和神经元细胞损伤情况。3、gp120 Tg小鼠腹腔注射MCC950和Z-YVAD-fmkgp120 Tg小鼠(11-12个月龄)和WT野生鼠分为4组(每组9只):WT+vehicle、WT+MCC950、gp120 Tg+vehicle和gp120 Tg+MCC950。vehicle为无菌PBS,MCC950浓度为10 mg/kg体重(溶解于无菌PBS),每只小鼠腹腔注射200μL/3天,持续80天。gp120 Tg小鼠(9-10个月龄)和WT野生鼠分成四组(每组6只):WT+vehicle,WT+Z-YVAD-fmk,gp120 Tg+vehicle和gp120 Tg+Z-YVAD-fmk。。vehicle为含有1%DMSO的无菌PBS,z-YVAD-fmk浓度为 10 mg/kg体重(在含 1%DMSO的无菌PBS溶解),每只小鼠腹腔注射200 μL/2天,持续30天。小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,取脑并匀浆裂解细胞,离心收集上清液并使用ELISA和WB测量IL-1β释放。4、小鼠行为学分析腹腔注射MCC950的四组小鼠进行Morris水迷宫和旷场实验,用TSE-VideoMot2视频跟踪系统跟踪动物的运动。自动记录移动的总距离、游泳速度、每个象限所用时间、平台位置交叉次数,在中心区域移动的距离、在中心区域花费的时间和中心区域条目的数量。人工记录排便频率。小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,采集血液和脑组织细胞裂解液上清,用ELISA进行IL-1β表达量的分析,及脑组织免疫组化分析大脑皮层和海马组织炎症因子和趋化因子表达。四、结果1、gp120Tg小鼠稳定表达gp120和小鼠增殖数量及月龄满足实验需求。2、gp120处理BV2细胞能诱导增加IL-1β、caspase-1和NLRP3的表达,体内外使用Z-YVAD-fmk(caspase-1特异性抑制剂)可呈剂量依赖性方式抑制gp120诱导的IL-1β释放,证实gp120诱导的IL-1β释放依赖于caspase-1激活。3、gp120处理BV2细胞,检测到ASC形成寡聚体,证明gp120可诱导ASC炎性体组装。NLRP3敲低的BV2细胞中仍然检测到比对照更高的IL-1β释放,提示可能涉及非caspase-1处理加工pro-IL-1β。ASC或caspase-1的敲低也明显减轻了 caspase-1活化和IL-1β的产生。同时MCC950可显著降低gp120诱导的IL-1β释放。gp120可促进IκBα降解和NF-κB p65核转位,并增强NLRP3和pro-IL-1β的表达。结果证明:gp120诱导的IL-1β产生受NLRP3-ASC-caspase-1的调节并引起细胞焦亡。4、高浓度K+抑制细胞K+外排时,gp120引起的IL-1β产生以剂量依赖性方式降低。用ROS抑制剂预处理BV2细胞也可抑制gp120诱导的IL-1β产生。表明,K+外排和ROS产生都是gp120引起的炎性体激活所必需的。用Kv1.3抑制剂或Kv1.3-siRNA发现BV2细胞NLRP3激活减弱,说明gp120诱导的NLRP3激活需要CXCR4-Kv1.3途径。5、gp120诱导的IL-1β释放且增加NO、TNF-α和COX-2神经毒性因子表达,用NLRP3和IL-1抑制剂显著抑制其表达。用gp120处理BV2细胞的上清液培养神经元细胞,引起明显的树突损伤,使用MCC950时神经毒性被阻断,提示gp120诱导的神经元损伤由NLRP3-IL-1β轴介导,且MCC950起保护作用。6、用MCC950治疗可阻断gp120 Tg小鼠中NLRP3炎症小体激活和IL-1β产生、改善神经炎症并促进M2小胶质细胞极化、减轻神经元损伤及改善小鼠的认知功能。五、结论1、gp120通过gp120-NLRP3-caspase-1-IL-1β通路引起神经系统损伤。2、NLRP3的抑制可降低gp120-caspase-1-IL-1β通路的激活和神经系毒性。3、MCC950改善gp120Tg小鼠神经毒性作用、认知功能和神经保护。