根瘤是豆科植物将空气中氮气转化为自身可利用氮的关键器官。根瘤固氮对提高土壤肥力、增加农作物产量以及减少工业氮肥的使用具有重要意义。固氮根瘤的形成涉及一系列反应如根瘤菌早期的侵染和根瘤器官的发生以及结瘤过程根发育的协调等,然而豆科植物本身的共生结瘤机制尚未完全清楚。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin,CYS)在结瘤,根瘤发育和衰老过程中起重要作用。本研究克隆了2个大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因GmCYS2和GmCYS20;通过体外蛋白酶活性抑制试验来揭示其生化功能;利用豆科模式植物百脉根作为载体,通过发根农杆菌介导的毛根转化技术在百脉根毛根中超量表达GmCYS2和GmCYS20基因,鉴定复合体百脉根共生结瘤表型来证实GmCYS2和GmCYS20基因在共生信号转导过程中的功能。研究生期间主要研究成果如下:1.克隆了2个大豆CYS家族基因GmCYS2和GmCYS20,氨基酸序列比对及进化树分析表明,GmCYS2与木豆(Cajanus cajan)CYS蛋白相似性高达73%。大豆GmCYS20蛋白与野生大豆(Glycine soja)CYS蛋白相似性高达99%。2.在大肠杆菌中表达和纯化GmCYS2基因编码的蛋白。通过检测重组蛋白GmCYS2的蛋白酶活性,发现此蛋白对L类、H类、B类组织蛋白酶均有抑制作用,且对L类和B类组织蛋白酶抑制活性高于H类组织蛋白酶。此外,接种30 d根瘤中蛋白提取物的蛋白酶抑制活性明显高于接种60 d的根瘤。3.构建GmCYS2,GmCYS20基因植物过表达载体,利用发根农杆菌介导的百脉根毛根转化法获得转GmCYS2,GmCYS20基因的超表达复合体植株。4.复合体植株在接种根瘤菌4周后,对根瘤数目进行统计分析发现转GmCYS2,GmCYS20基因植株结瘤数目明显高于空载体对照。5.通过实时荧光定量PCR检测NIN、ENOD40-1和ENOD40-2这3个与结瘤相关的基因在超表达植株中的表达水平,结果显示与空载体对照相比,结瘤指示基因的转录水平明显升高。6.进一步对接种10 d复合体植株中根瘤菌的侵染表型进行统计发现,过量表达GmCYS20基因并不影响根瘤菌的侵染过程,而是在根瘤起始与发育阶段发挥正调控作用。以上结果说明GmCYS2蛋白具有酶活性抑制作用,正向调控百脉根结瘤过程。GmCYS20基因可以通过促进根瘤的起始与发育,来调控共生结瘤过程。以上结果将为揭示豆科植物与根瘤菌共生结瘤机制提供新的重要的基因信息和理论基础。