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乙醛是啤酒中的主要风味物质之一，低浓度的乙醛使啤酒具有芳香味，高浓度则产生像青草或者苹果腐烂的味道。以国内啤酒为例，乙醛含量多在5-12mg/L，而国外优质啤酒的乙醛含量多在3mg/L以下。目前，国内啤酒生产中控制乙醛含量采用的方法主要是生产工艺改良，但实际效果并不明显。乙醛含量已经成为国内啤酒风味改良的瓶颈，一直难有突破。随着基因重组技术的发展，在基因水平上对酿酒酵母进行修饰，最终实现降低乙醛含量的目的已经成为可能。本文利用自克隆技术，构建了一株新型啤酒酵母工程菌，并对其进行了小型发酵试验，检测了重要的产物含量和发酵指标。实验主要内容和结果见下：
根据文献报道的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)乙醇脱氢酶Ⅱ(ADH2)基因序列设计引物，以YSF31的总DNA为模板进行PCR扩增，获得ADH2基因及其上游700bp序列的一段DNA片段，将该片段插入到质粒YEp352上，构建了重组克隆质粒pYA。将筛选标记基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1插入到质粒pYA的ADH2基因中，构建了重组质粒pACG。用PvuⅡ酶切重组质粒pACG得到一个DNA片段：含有铜抗性基因CUP1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1，两端含有ADH2基因的5’端和3’端序列。用此DNA片段转化啤酒酵母YSF31，使该片段与染色体在ADH2位点发生同源重组。通过细胞对硫酸铜的抗性筛选到转化子。经PCR验证，片段成功重组到受体菌的染色体上。由于遗传操作引入的基因片段都是来源子酵母自身，故该工程菌被称为自克隆菌株。
对受体菌和自克隆菌株的铜抗性进行测定，结果显示受体菌和自克隆菌株在含有5mmol/LCuSO4YEPD培养基上都能生长，受体菌在含有6mmol/LCuSO4的YEPD培养基上就不能生长。而自克隆菌株在含有6mmol/L，7mmol/L，8mmol/LCuSO4的YEPD培养基上均能生长。经检测，自克隆菌株的铜抗性达到8.5mmol/L的Cu2+浓度。对受体菌和自克隆菌株的GSH含量进行测定。结果显示，在酵母胞内自克隆菌株的GSH含量比受体菌高15％；在发酵液中自克隆菌株的GSH含量比受体菌高42％。铜抗性和GSH含量测定的结果说明，CUP1基因和GSH1基因被重组到受体菌的染色体上，并成功共表达。
对受体菌和自克隆菌株进行的小型发酵试验结果显示，发酵液中的谷胱甘肽含量，自克隆菌株比受体菌YSF31高34％。而ADH2基因的破坏，使ADHⅡ酶活性明显降低，自克隆菌株的酶活是受体菌的65％。自克隆菌株的其它发酵指标如α-N氨基酸同化率、真正发酵度等与受体菌基本相同。由CO2减重实验和真正发酵度的检测结果可以看出，自克隆菌株的发酵速度和发酵度基本没有发生变化，说明遗传修饰没有影响酵母的发酵能力。
本研究采用自克隆技术，首次将啤酒酵母工业菌株中的ADH2基因敲除，同时在该位点插入一个CUP1基因和GSH1基因，获得了低ADHⅡ酶活性高GSH含量的啤酒酵母工程菌，为构建低乙醛抗老化的啤酒酵母工程菌奠定了基础。