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第一部分计算机辅助设计联合斑点杂交筛选铜绿假单胞菌PAO1motA基因反义寡核苷酸序列
目的：采用全基因寻靶技术(full length gene targeting，FLGT)筛选能与铜绿假单胞菌PAO1motA基因的mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列。方法：采用计算机软件(Mfold和RNA Structure4.6)模拟铜绿假单胞菌PAO1motA基因mRNA的二级结构，根据最小自由能原理设计出6条反义寡核苷酸探针序列，另设两条阴性对照：一条为随机设计的阴性对照序列，另一条为与motA基因上的一段碱基完全一样的序列。克隆motA基因并进行体外转录，同时用地高辛标记motA mRNA，以斑点杂交方法筛选出与motA基因mRNA结合紧密、杂交信号较强的反义寡核苷酸序列。结果：PCR扩增出motA基因的全长(852bp)，斑点杂交显示6条反义寡核苷酸中的4条显示出杂交信号。结论：成功筛选到了能与motA mRNA牢固结合的反义序列，为进一步研究以motA基因为靶的反义技术抑制生物膜形成打下基础。
第二部分肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PA01生物膜形成的研究
目的：研究肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的抑制作用，探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法：根据第一部分筛选出的的反义寡核苷酸的序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell penetrating peptide，CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA，分别采用不同浓度的CCPs，PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1，定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用，同时检测其对motA基因表达的抑制作用以及对PAO1运动能力的影响。结果：PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用，并且随着浓度的增加，其抑制作用也增加，但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30％、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜的形成基本上没有影响，5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成基本上没有影响。PNA和CCPs-PNA对motA基因的表达均有抑制作用，但CCPs-PNA的抑制明显优于PNA组。与对照组相比，CCPs-PNA处理之后的PAO1，其运动能力明显下降，PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3:5。结论：针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成具有抑制作用，穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。