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1.研究背景流行病学已表明年龄是AS的独立危险因素之一。随着年龄的增长,血管逐渐出现内皮细胞损伤、内膜下炎症、泡沫细胞形成、斑块破裂等动脉粥样硬化改变。大量研究显示增龄性血管的这些改变可能因为之一为各种血管细胞衰老引起。但这些细胞衰老改变的具体机制尚不明确。目前衰老学说的机制主要从分为两大类型:环境伤害衰老理论和遗传因子程序化衰老理论。随着细胞分子生物学的进展,人们发现,这两类理论并非是独立的,而是环境和遗传相互影响的过程。而在AS改变中,血管作为循环系统,与机体所有细胞交换营养代谢物质,处于受各种环境损伤因素的中心,特别是以活性氧簇（ROS）为主要形式的活性自由基的损伤。故首先我们需要探讨的就是以活性氧损伤为代表的自由基损伤衰老学说。大量研究表明过量的ROS所引起细胞衰老在AS中扮演重要角色,而近期有研究发现AS斑块中具有多种表型的衰老的巨噬细胞,也进一步发现清除小鼠AS斑块中衰老的巨噬细胞可明显减缓AS进展,衰老的巨噬细胞可能在早期斑块中,通过释放炎性因子及趋化因子加速AS进展,而在晚期斑块中,衰老的细胞促进斑块的不稳定,表达并释放更多蛋白水解酶,促进弹性纤维降解和纤维帽变薄。以往ROS对细胞衰老影响的研究主要侧重于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞,作为AS斑块中重要的巨噬细胞的衰老研究相对较少,为此我们想进一步观察是否ROS可以加速巨噬细胞的衰老,以及衰老的巨噬细胞会出现怎样的生物学改变?大量研究表明,白藜芦醇（Resveratrol,Res）能保护血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经元细胞等,延缓细胞衰老、减少炎症因子的释放,对抗动脉粥样硬化相关的心脑血管疾病、阿尔兹海默病等老年病。那么Res是如何在细胞分子生物水平调节细胞衰老呢?具体机制仍未明确。Res抗衰老的研究主要体现在其是沉默信息调节相关酶1（SIRT1）的最强激动剂,而SIRT1作为sirtuins家族成员之一,主要有NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶活性,参与调节DNA的损伤修复、基因的转录调控、细胞周期、细胞凋亡、代谢及衰老等生物过程。自噬是真核细胞胞质内形成双层囊膜结构吞噬底物与溶酶体融合后形成自噬溶酶体并降解受损的蛋白质、衰老的线粒体等细胞器的过程,自噬的机制非常复杂,并发现自噬与动脉粥样硬化等衰老疾病、肿瘤、炎症、退行性疾病等密切相关。近年来随着自噬机制的发展,已在多种细胞内观察到SIRT1调控着细胞自噬,并发现白藜芦醇可能通过去乙酰化调控自噬相关蛋白诱导细胞自噬,究竟是白藜芦醇作为SIRT1激动剂改善细胞衰老,还是白藜芦醇通过自噬在延缓衰老发挥巨大作用以及两者之间是否存在着相互作用的信号分子通路,这些仍需大量研究进一步探索。因此,本研究旨在通过H2O2诱导体外培养的人THP-1巨噬细胞衰老,观察研究白藜芦醇对其的干预处理及其自噬机制,另外需进一步进行抑制自噬相关信号通路和开发动物的研究,这可能是一种新的思路来治疗动脉粥样硬化和其他衰老疾病。2.方法2.1 THP-1巨噬细胞的诱导分化:以160nmol/L佛波酯的10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基刺激人THP-1单核细胞株36h诱导为THP-1巨噬细胞。2.2各浓度白藜芦醇对H2O2诱导衰老的THP-1巨噬细胞活性的影响及分组:CCK-8还原法测定细胞活性。2.3 THP-1巨噬细胞衰老情况检测:采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-GA）染色。对各组细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-GA）染色,测定阳性细胞百分率。2.4THP-1巨噬细胞内Rb、pRb、LC3、Beclin 1、p62蛋白以及内参蛋白表达检测:采用 Western blotting 法。2.5 LC3蛋白免疫荧光:使用特异性LC3抗体与LC3蛋白结合,通过荧光显微镜,可以观察到绿色荧光斑点来确定自噬的发生。2.6 THP-1巨噬细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6的含量测定:提取上清液,ELISA法测定,严格按照试剂盒操作。2.7统计分析:以上实验均重复3～5次,取平均值。采用SPSS22.0统计软件。计量资料用x±s表示,多组比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。率的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。3.结果3.1各浓度白藜芦醇对H2O2诱导衰老的THP-1巨噬细胞活性的影响CCK8结果示:高浓度H2O2在12h即引起细胞生长停滞,活性降低;而低浓度的H2O2在48h内仍未引起细胞生长停滞,故本文选用300μmol/L进一步观察其引起THP-1巨噬细胞衰老的可能性。根据CCK8结果选用40μmol/L浓度的白藜芦醇进一步观察其引起Res对H2O2诱导THP-1巨噬细胞衰老的影响。故按下列分组进行实验:①空白对照组;②300μmol/LH2O2组;③40μmol/L Res+300μmol/LH2O2 组;④40μmol/LRes 组。3.2 THP-1巨噬细胞衰老情况检测与对照组相比,H2O2组细胞SA-β-gal染色阳性率明显增加;经过Res干预后,与H2O2组比较,SA-β-gal染色阳性率明显增加减少,表示Res可以改善H2O2氧化应激导致的细胞衰老。3.3 THP-1巨噬细胞p-Rb、Rb蛋白表达情况与对照组相比,H2O2处理后THP-1巨噬细胞p-Rb蛋白表达降低、Rb蛋白表达增加,经40 μmol/L的Res干预后,能上调pRb蛋白表达、下调Rb蛋白表达。3.4 THP-1巨噬细胞LC3、Beclin-1、p62蛋白表达情况与空白对照组比较,H2O2处理后THP-1巨噬细胞下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白的表达,上调p62表达;与H2O2组比较,Res干预后THP-1巨噬细胞上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白的表达,而p62蛋白表达减少。3.5 LC3蛋白免疫荧光染色与空白对照组比较,H2O2处理后THP-1巨噬细胞后高亮点绿色荧光变弱;与H2O2组比较,Res干预后THP-1巨噬细胞内高亮点绿色荧光明显增强。3.6白藜芦醇对H2O2诱导的THP-1巨噬细胞炎性因子的测定与空白对照组比较,H2O2处理后THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平显著升高,与H2O2组比较,Res干预后THP-1巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低。4.结论4.1过氧化氢通过氧化应激诱导THP-1巨噬细胞衰老,增加炎性因子的分泌;4.2白藜芦醇可能通过促进细胞自噬来抑制过氧化氢诱导的THP-1巨噬细胞衰老,减轻炎性反应,延缓动脉粥样硬化的进展。