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目前,鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是感染鸭群的最小病毒,可造成感染鸭发育不良、羽毛脱落、及免疫抑制等病理损伤。DuCV感染呈全球分布趋势,已成为危害水禽产业发展的重要病原之一,但由于缺乏合适的体外培养细胞系,目前关于该病毒疫苗的研究还非常有限。因此,本研究拟通过对DuCV Cap(Capsid,Cap)进行基因修饰,利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)构建重组DNA疫苗,并对其诱导的鸭免疫反应及抗DuCV感染能力进行初步研究。1.基于DuCV Cap基因的重组质粒构建及表达分析 DuCV Cap 的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)和 tPA 的分泌信号肽(tPA’),以DuCV GH01为模板扩增Cap全长基因和截去NLS区域的Cap△NLS,重叠PCR扩增得到tPA’-CapANLS基因,酶切及测序结果显示Cap、CapANLS和tPA’-CapANILS片段大小分别为774bp、666 bp和 735bp,均符合理论大小。将各目的片段分别克隆到表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒鉴定结果显示pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-CapANLS和pcDNA3.1-tPA’-CapANLS构建成功。各重组质粒分别转染COS 7细胞,48 h后对各组细胞进行IFA检测,对细胞外液进行Western blot检测。结果显示 pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-CapANLS 和 pcDNA3.1-tPA’-CapANLS 均能在COS7细胞中表达,其中pcDNA3.1-tPA’-CapANLS的表达量最高,且能够将部分目的蛋白分泌到细胞外。2.DNA 疫苗 pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-CapANLS 和 pcDNA3.1-tPA’-CapANLS 的免疫原性研究制备DuCVGH01株的病毒悬液,测定得到其半数感染量(ID50)为5.93×103.5 copies/mL。将 DNA 疫苗 pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-Cap△NLS 和 pcDNA3.1-tPA’-Cap△NLS,以及PBS和pcDNA3.1(+),以200μg/只的剂量,分别肌注接种4日龄樱桃谷鸭,2w后进行加强免疫。于一免后第0w、1w、2w、3w、4w、5w、6w和第8 w采集鸭血清,二免后第Ow、1w、2 w和第4 w采集外周血。同时在一免后第4w,从每组鸭中随机选取10只,颈背部皮下注射DuCVGH01株病毒悬液(105.5ID50/只),4 w后采集其脾脏、法氏囊、胸腺和哈德氏腺。结果表明:①三种DNA疫苗均在一免后第3 w检测到特异性Cap抗体,抗体水平从第3 w到第8 w间都显著高于对阴性照组(p<0.01);pcDNA3.1-tPA’-Cap△NLS组的特异性血清抗体水平显著高于 pcDNA3.1-Cap 组和 pcDNA3.1-Cap△NLS 组(P<0.05),并在一免后第 8 w 依然有缓慢上升的趋势;同时pcDNA3.1-Cap组抗体水平显著高于pcDNA3.1-Cap△NLS组(P<0.05)。②免疫组 pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-Cap△NLS 和 pcDNA3.1-tPA’-Cap△NLS 的 CD4+、CD8+、IL-4、IL-10、IL-12 和 IFN-γ含量显著高于阴性对照组(P<0.05),表明三种载体疫苗都能够促使机体产生细胞免疫反应,同时激活Th1型和Th2型辅助性免疫反应;各免疫组间的CD4+、CD8+、IL-4和IL-12分泌量差异不显著(P>0.05),但pcDNA3.1-Cap刺激机体产生的免疫抑制性因子IL-10与促病毒清除因子 IFN-y都要显著高于 pcDNA3.1-Cap△NLS 和 pcDNA3.1-tPA’-Cap△NLS 组(P<0.05)。④攻毒后第4w,阳性对照组的脾脏、法氏囊、胸腺和哈德氏腺显著肿大,重量显著大于阴性对照组(P<0.05),DuCV感染比率均为100%(10/10),感染鸭的脾脏中 DuCV 病毒含量高达 104.5copies/mg;pcDNA3.1-Cap、pcDNA3.1-Cap△NLS和pcDNA3.1-tPA’-Cap△NLS组的鸭免疫组织大小重量与阴性对照组无明显差异(P>0.05),DuCV 感染比率分别为 20%O(2/10)、40%(4/10)和 10%(1/10),其中感染鸭的脾脏中DuCV含量均低约101.5copies/mg。