论文部分内容阅读
背景：胃癌的发生是一种多因素、多阶段逐步演变的过程，其发生发展与胃癌细胞环氧合酶-2（Cyclooxygenase2,COX-2）基因和5-脂氧合酶（5-Lipoxygenase,5-LOX）基因过高表达有关。我们的前期研究发现，COX-2/5-LOX抑制剂能抑制胃癌细胞中COX-2与5-LOX基因的表达，显著抑制胃癌生长，且效果较单独抑制其中一个基因效果好[3,4]。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种转录后基因沉默现象，其中shRNA由于具有高效、特异、快速、可遗传等优点。采用RNAi技术能否同时沉默胃癌细胞的COX-2和5-LOX基因尚未见报道。目的：构建P-shCOX-2、P-sh5-LOX表达质粒，观察共同转染沉默COX-2/5-LOX基因对胃癌SGC-7901细胞生长的影响。方法：1．分别构建2个5-LOX及COX-2基因靶向短发夹RNA(shRNA)的真核表达质粒（P-sh5-LOX、P-shCOX-2）；2．共同转染（Lipofectamine2000）胃癌细胞SGC-7901，荧光显微镜下观察胃癌细胞中绿色荧光蛋白的表达，RT-PCR检测胃癌细胞5-LOX及COX-2的mRNA表达，Westernblot法检测胃癌细胞5-LOX及COX-2的蛋白表达；3．MTT法检测胃癌细胞的增殖能力，流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡率。结果：1．测序证实成功构建P-sh5-LOX、P-shCOX-2重组质粒；2．转染后荧光显微镜下见绿色荧光表达，空质粒转染组5-LOXmRNA及COX-2mRNA（0.58±0.02，0.82±0.05）分别与未转染组间（0.68±0.02，0.89±0.08，）无显著差异（P＞0.05）；Psh-5-LOX组5-LOXmRNA（0.38±0.06）、Psh-COX-2组COX-2mRNA（0.57±0.04）和共同转染组5-LOXmRNA及COX-2mRNA（0.35±0.06，0.50±0.02）表达显著低于未转染组及空质粒转染组（P＜0.05）；空质粒转染组5-LOX蛋白及COX-2蛋白表达（0.73±0.02，0.81±0.02）较未转染组（0.75±0.03，0.83±0.04）无显著差异（P＞0.05）；Psh-5-LOX组5-LOX蛋白（0.41±0.02）、Psh-COX-2组COX-2蛋白（0.36±0.01）和共同转染组5-LOX蛋白及COX-2蛋白的表达（0.39±0.01，0.33±0.01）显著低于未转染组及空质粒转染组（P＜0.05）；3．MTT结果显示：P-sh5-LOX组抑制率（27.38±0.64）%、P-shCOX-2组抑制率（29.05±0.61）%及共同转染组抑制率（50.23±1.73）%分别较空质粒组（3.78±0.39）%显著升高（P＜0.05），共同转染组抑制率显著高于单独转染组（P＜0.05）；4.流式检测结果显示：P-sh5-LOX组、P-shCOX-2组及共同转染组凋亡率分别为（15.31±1.53）%、(16.69±1.28)%和（27.27±1.18）%，较空质粒组凋亡率（0.99±0.46）%显著升高，且共同转染组凋亡率高于单独转染组，差异有显著性（P<0.05）。结论：1.共转染能同时有效沉默胃癌细胞SGC-7901的5-LOX及COX-2基因；2.沉默5-LOX/COX-2基因对胃癌细胞SGC-7901有抑制增殖，促进凋亡作用；同时沉默这两个基因时对胃癌细胞抑制增殖促进凋亡效果优于单独沉默其中任何一个基因(P＜0.05）。