萜类化合物是一类广泛存在于自然界中具有高度结构多样性的化合物,在人类日常生活中发挥着举足轻重的作用。目前研究人员已通过代谢工程及组合生物合成策略,利用微生物发酵方式实现了多种萜类化合物的商业化生产。其中一些化合物被广泛应用于香水生产行业、保健品行业、农业生产领域以及医疗行业。在自然界中,萜类化合物可经2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)和甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径合成,生物体可利用这两个途径以及异戊烯基焦磷酸异构酶(Idi)合成萜类化合物前体物质异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP),随后经异戊烯转移酶(prenyltransferases,PT)催化合成不同链长的异戊二烯单元。并经萜类合酶(terpene synthases,TPSs)催化,合成不同类型的萜类化合物。因而构建一个高效的IPP和DMAPP合成平台是实现萜类化合物高效合成的关键。为此,我们利用课题组开发的定向代谢工程策略,通过过表达MVA途径,在大肠杆菌(Escherichia coli)体内构建了合成萜类化合物的平台。并以紫杉二烯为研究对象,通过一步构建,成功地在 E.coli体内实现了紫杉二烯的高效合成。为其它二萜类化合物在E.coli体内的高效合成奠定了基础。随后将这一策略应用到丝状真菌交链格孢(Alternaria alternata)中,实现了紫杉二烯的稳定合成。在构建A.alternata萜类化合物合成平台之前,我们首先建立了基于农杆菌转化(ATMT)的A.alternata TPF6遗传操作系统。该系统的建立使得我们对其进行代谢工程改造成为可能。为了实现对外源基因的表达进行较为精确的控制,我们借助于荧光显微镜以及RT-PCR研究了 TPF6体内6个外源启动子的强度。随后将其应用于TPF6的代谢工程改造工作中去,在过表达了外源的Idi、tHMG1以及TS后,我们在突变株A.alternata GB127中成功地检测到了 61.9±6.3μg/L的紫杉二烯。这是首次报道在丝状真菌体内实现紫杉二烯的稳定合成,为利用微生物合成紫杉醇提供了一个新的思路。ATMT方法的建立以及外源启动子强度的验证为我们对其进行进一步的代谢工程改造提升紫杉烷类化合物产量奠定了基础。此外,我们还构建了高效供给萜类化合物前体物质的在酿酒酵母(Saccharommyces cerevisiae)平台,为萜类化合物在S.cerevisiae体内的高效合成奠定了基础。为了拓展定向代谢工程指导的高产萜类化合物平台的应用范围,我们进而将该平台用于萜类化合物的挖掘。萜类环化酶(terpene cyclase)能够催化含有不同链长异戊二烯单元的底物合成单环或者多环的萜类化合物。随后这些合成的萜类化合物骨架在不同的部位经一系列的加氧酶、甲基转移酶,酰基转移酶以及糖基转移酶等酶催化一系列后修饰步骤形成数以千计的萜类化合物。因而,挖掘新的萜类环化酶是拓展萜类化合物结构多样性的一个决定性步骤。然而,目前人们对该元件以及萜类化合物生物合成途径中的其它元件的挖掘还远远不足,这也直接阻碍了那些高附加值的萜类化合物的代谢工程研究和商业化生产。基因组测序及注释为研究人员提供了大量未知功能的萜类合酶。这其中许多萜类环化酶具有底物和反应杂泛性(promiscuous),能够接受不同链长的底物合成种类丰富的萜类化合物。然而,传统的基因组挖掘(genome mining)方法通常受限于异源表达宿主的产物合成能力,仅能对其中主要的产物进行挖掘鉴定,这在很大程度上掩盖了这些萜类环化酶的生物合成潜力。因而,开发一个高效的萜类化合物生物合成元件及其产物挖掘平台,对一些潜在的新的萜类环化酶进行研究从而发现新的萜类化合物是加速萜类化合物研究进程的关键所在。为此,本研究对丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012菌株(Fusariumgraminearum J1-012)的基因组信息进行生物信息学分析,从基因组中挖掘I型多功能萜类环化酶。对其进行克隆并开展体外实验对其生物学功能进行验证。结果显示,FgMS和FgGS两个酶具有显著的底物和反应杂泛性,能够以GPP、FPP、GGPP以及GFPP为底物合成多种类型的萜类化合物。为了充分了解这两个具有底物及反应杂泛性的萜类合成酶的萜类化合物合成能力,我们构建了一个含有3个不同模块的萜类化合物生物合成平台。第一个模块为基于MVA途径高产平台,该平台能够提供尽可能多的IPP和DMAPP,用于后续不同类型萜类化合物的生物合成。第二个模块为含有不同来源的能高效合成聚异戊烯焦磷酸的法尼基焦磷酸合成酶(FPPS),香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)以及香叶基法尼基焦磷酸合成酶(GFPPS)的文库。第三个模块为多功能的萜类合酶。以此为基础,我们构建了 6个突变株来充分挖掘FgMS和FgGS的萜类化合物合成能力。最终结果显示,他们能够合成多达52种单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜。我们对其中的12个产物进行鉴定,结果显示,其中化合物1、2、5,7-10为新的二萜和二倍半萜化合物,这其中包含有3个新骨架化合物。显示了这两个酶强大的萜类化合物合成能力以及该组合生物合成平台的高效性。随后,为了进一步增加产物的多样性,我们对其中的FgMS进行同源建模,并对其活性口袋附近的潜在的非保守的氨基酸位点进行分析及定点突变。体外研究结果显示F65L和F159G能够合成6个潜在的新的二倍半萜化合物。随后我们通过体内发酵实验获得了化合物56并鉴定其为新的二倍半萜类化合物。这一组合生物合成结合酶的理性改造策略使得我们充分地挖掘了 FgMS和FgGS的生物合成潜力,加速了新的萜类化合物的挖掘进程。此外,我们还开发了基于酿酒酵母平台的萜类化合物生物合成元件及产物挖掘的方法。为此,我们以过表达了 tHMG1的S.cerevisiaeYZL141为平台,过表达了法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)和F.graminearum J1-012来源的另一个具有底物和反应杂泛性的萜类合酶FgFS,使其能够高效合成FgFS的产物。发酵结果显示,FgFS能够合成10种倍半萜化合物。对其中8个主要产物进行鉴定,结果显示,化合物1-3为新骨架化合物,其中化合物2和3为顺反异构体体。化合物4为具有重要应用价值的橙花叔醇。同时,结合同位素标记实验阐明了新骨架化合物1-3的合成机理。这一系统的代谢工程辅助天然产物挖掘工作的开展为其它萜类合酶的功能验证以及新骨架化合物的挖掘提供了一个成熟的解决方案。上述实验表明,将组合生物合成、代谢工程、酶的理性改造等策略用于萜类化合物生物合成有关基因的功能验证及产物的挖掘是一个非常有意义的工作,这将在很大程度上加快萜类环化酶元件及其产物的挖掘速度并以及加深我们对萜类环化酶的认识。