目的： 高同型半胱氨酸(tHcy)血症作为动脉粥样硬化的独立危险因子得到了广泛的重视。研究同型半胱氨酸(Hcy)代谢过程中关键酶的基因多态性是否影响血浆半胱氨酸浓度进而是否与心脑血管病相关成为必要。本研究检测动脉粥样硬化性脑梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者与正常对照者的血浆半胱氨酸浓度及MTRRA66G基因多态性，探讨蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G基因多态性对血浆半胱氨酸浓度的影响，并研究其在中国华东地区汉族人群中的分布及其与动脉粥样硬化性脑梗塞的关系。 方法： 1、实验分组： 本实验选取2004年9月-2005年6月间本院神经内科动脉粥样硬化性脑梗塞(atheroscleroticcerebralinfarction，ACI)患者94例，定为： (A)动脉粥样硬化性脑梗塞(ACI)组94例(男46例，女48例)，年龄43-80岁(59.0±10.5)岁。均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经头部CT及(或)MRI证实。不包括心律失常、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的ACI；排除梗死后出血，肝、肾功能障碍的病例，以及自身免疫性疾病、妊娠、半年内曾降脂治疗者。 (B)正常对照组，选取2004年-2005年本院查体中心健康查体者145例(男75例，女70例)，年龄40-77岁(57.3±10.9)岁。均经临床检查和(或)影像学检查排除心、脑血管病，无脑血管病家族史，排除肝、肾疾病、血液病、自身免疫性疾病、妊娠、半年内曾有降脂治疗者。两组之间性别、年龄、体质量指数(BMI)无显著性差异。所有入选者均为华东地区汉族，相互间无血缘关系。 2、血清生化指标、血浆半胱氨酸浓度测定： 所有受试者取清晨空腹外周静脉血5ml： 2ml静止30分钟后离心取血清，应用OlympusU640自动生化分析仪测定血清胆固醇TCH、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL及血糖TG； 3ml与1.5mg/mlEDTAK2按100∶1体积抗凝，立即2000转/分离心5分钟，取20ul血浆用于测定血浆中半胱氨酸浓度，剩余血样置4℃冰箱中储存，一周内成批提取DNA。 所有观察对象均于采血当日收集病史。 3、MTRR基因A66G多态性检测： 取20ul血浆后的血样置4℃冰箱中储存，一周内成批提取DNA(应用美国Promega公司出品的DNA纯化试剂盒)，DNA提取液置-20℃冰箱中储存。 应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测样本MTRR基因。引物设计参考文献设计为： Primer1∶5-CAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGACAT-3 Primer2∶5-CACTTCCCAACCAACCAAAATTCTTCAAAG-3 配制25μl反应体系，基因组DNA200ng、引物20pmol、MgCl21.5mmol/L、dNTP200μol/L、tag酶1U。 94℃预变性5min，95℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸45s，进行40个循环。最后1次循环后72℃延伸7min。 然后用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，-20℃保存。 将扩增产物提纯后，取22μl扩增产物，10×buffer3μl，H2O1.5μl，限制性内切酶(NadeI)10U，37℃水浴消化过夜，以5.5％琼脂糖电泳分析酶切产物，溴化乙锭染色，UVA凝胶成像系统检测、摄片。 由两人分别判读基因型，对于不确定者选出重做。判读方法如结果所示，比较两组基因型和等位基因频率分布有无差异。 4、统计学处理： 全部数据采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据经正态检验后，正态分布量以(x)±s表示，非正态分布变量以对数转换近似正态分布。遗传平衡吻合度检验用Hardy-Weinberg平衡法。数值型变量采用单因素方差分析，分类变量采用X2非参数检验。危险因素分析采用单因素Logistic回归。 结果： 1、血浆半胱氨酸水平： 血浆半胱氨酸水平在ACI组(18.9±12.7μmol/L)显著高于正常对照组(7.3±3.3μmol/L)，p＜0.001。 2、MTRRA66G基因型 MTRR基因第66位单个碱基腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，表现为AA、AG、GG三种基因型。研究证实野生纯合子(基因型AA)存在NadeI酶切位点，酶切后电泳有124、27、151bp，无酶切位点酶切后电泳只有151bp片断。 即AA：124、27bp，AG：124、151、27bp，GG：151bp。 3、基因型分布比较 MTRR基因A66G多态性在研究人群中的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(ACI组Df=1，x2=1.22，p＞0.05；对照组Df=1，x2=0.61，p＞0.05)，说明本研究组人群具有群体代表性，不存在选择偏倚。AA、AG、GG基因型频率在ACI组为12.8％、53.2％和34％，对照组分别为26.2％、53.1％和20.7％。组间基因型频率差异有显著性(x2=8.84，p=0.01)。 4、基因多态性与血浆Hcy水平的比较组内比较GG基因型血浆半胱氨酸浓度均高于其他两种基因型。 5、ACI形成危险因素分析： 以血浆Hcy浓度、MTRR基因型、TCH、Glu和HDL为自变量，ACI发生为因变量的Logistic多元回归分析显示，血浆Hcy浓度、TCH、Glu是危险因素；相关分析显示，血浆Hcy浓度与TCH、Glu均无相关性，表明Hcy浓度升高是ACI发生的独立危险因素，OR=1.286。而MTRR基因型并非独立危险因素。 结论： 1、同型半胱氨酸可通过刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶平衡，使内皮损伤和功能异常等，使机体处于血栓前状态，从而增加了心脑血管疾病发病的危险性。本实验中血浆半胱氨酸水平在ACI组显著高于正常对照组，证实高Hcy血症与动脉粥样硬化性脑梗塞有关，是ACI的独立危险因素之一。 2、MTRR催化无活性蛋氨酸合成酶转换成有活性的酶，从而在蛋氨酸和叶酸循环中起重要作用。发生突变后蛋氨酸残基被异亮氨酸替代，有可能影响酶的催化活性，导致半胱氨酸代谢受阻。本次结果中MTRRAA、AG基因型同型半胱氨酸水平与GG基因型同型半胱氨酸水平相比有明显差异，说明MTRR基因型不同会影响Hcy在血浆中的浓度。 3、MTRR多态性位点等位基因频率在不同种族中有差异性，本次研究首次揭示了华东地区汉族MTRR基因的等位基因频率(A等位基因47.45％、G等位基因52.45％)，两组间等位基因频率分布无显著性(p＞0.05)。在本研究中MTRR基因A66G多态性在研究人群中的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡，MTRRAA、AG、GG基因型频率在ACI组为12.8％、53.2％和34％，对照组分别为26.2％、53.1％和20.7％，AA、AG、GG基因型频率在组间有差异，且有统计学意义(p＜0.01)。提示MTRR多态性可能与动脉粥样硬化性脑血管病有关，G等位基因可能是中国人缺血性脑血管疾病的遗传易感标志之一 4、基因型与血浆半胱氨酸水平的相关性，提示基因型通过决定血浆中半胱氨酸水平再影响发病，基因型与缺血性脑血管病相关是间接的。MTRR基因多态性并非ACI发生的独立危险因素。