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背景:石骨症（Osteopetrosis）是一类以骨密度异常增加为主要特征的罕见骨发育障碍性疾病。该病一般临床表现为骨吸收活动障碍或减弱，钙化的软骨或其他异常骨样组织堆积，骨质脆性增加、硬化，导致骨髓腔变窄甚至消失而出现贫血等症状。自从1904年国外首次报道该病以来，人们研究发现该病的发生和发展与破骨细胞发育及功能障碍存在着密切的关系。多年来，石骨症致病基因诊断以及治疗是该病研究的重点。迄今为止，人们发现了数十个石骨症相关基因，但尚缺乏行之有效的治疗方法。临床上，由于石骨症致病基因较多且基因序列较长，给石骨症基因诊断带来了较大困难。一些研究结果表明全外显子组测序技术只针对外显子区域DNA进行分析，具有经济和高效等优点，可能是石骨症基因诊断的新途径。基因表达不仅仅从基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等单向流动，而是相互联系形成一个复杂调控网络。因此，深入理解和应用中心法则，在基因组、转录组和蛋白质组等水平上进行多角度贯穿性研究，有可能加深传统遗传性疾病发病机制的理解，并为新药物研发提供新信息。最近，研究表明某些特定microRNA可以控制疾病转归，提示microRNA可能作为“新药”用于人类疾病治疗。然而，在利用microRNA治疗人类疾病之前，非常有必要对特定遗传背景的疾病状态下各种组织、细胞中差异表达microRNA及其靶基因进行深入了解。因此，本课题首先采用全外显子组测序技术分析石骨症家系患者的致病基因，然后采用microRNA测序技术和iTRAQ蛋白质组学技术描绘石骨症患者外周血单个细胞（PBMCs）差异microRNA表达谱以及蛋白质组表达谱，最后综合利用这两种表达谱数据以及microRNA靶基因预测软件分析结果，在基因和microRNA的角度为石骨症的发病机制和治疗提供新信息。目的:从基因组学的角度，筛选和鉴定石骨症家系患者致病基因突变位点；从microRNA、蛋白质组学和生物信息学的角度，寻找可能与石骨症相关的microRNA及其靶基因信息，为石骨症产前基因诊断以及治疗提供依据。方法:1.石骨症致病基因定位及突变鉴定对一个现存17个家系成员的石骨症家系进行家系调查，采用DNA捕获技术捕捉2例石骨症家系患者的全基因组外显子DNA，富集后进行高通量测序，利用生物信息学技术对测序数据信息进行分析，如SNP、InDel检测、注释、统计和过滤等，得到候选石骨症致病突变位点信息。采用PCR和Sanger测序技术验证全外显子组测序分析获得的候选石骨症致病突变位点在石骨症家系成员以及我国人群中的分布情况。2.石骨症相关microRNA及其靶基因分析提取6例携带CLCN7(Y99C)突变的石骨症患者和9例对照人群受试者全血标本中的PBMCs，并把每个标本分成两份，一份用于差异microRNA表达谱分析，另一份用于差异蛋白质组学分析。microRNA测序：利用PBMCs提取的总RNA构建石骨症组和对照组cDNA测序文库，并进行高通量测序，分析测序文库中microRNA的表达情况；iTRAQ蛋白质组学分析：提取PBMCs总蛋白，利用iTRAQ试剂对肽段标记后进行液相色谱-串联质谱分析。然后采用整合多个靶标预测软件的StarBase分析差异表达microRNA的靶基因，并与差异表达蛋白对应的基因取交集，获得可能存在相互作用的候选microRNA/蛋白对。最后应用RT-qPCR、Western blot以及双荧光素酶报告基因技术验证microRNA/靶蛋白对的表达水平以及相互作用关系。结果:1.石骨症致病基因定位及突变鉴定(1)利用外显子捕获技术成功捕获了两例石骨症患者的全基因组外显子DNA，高通量测序的平均深度分别是83×和81×，对两例患者基因组中均存在的基因变异进行过滤分析发现国外已经报道CLCN7(Y99C)是该石骨症家系的候选致病突变。(2) Sanger测序验证发现CLCN7(Y99C)存在于6例家系患者基因组内，但不存在于其他家系成员和100例对照人群基因组内。(3)结合石骨症家系临床资料和Sanger测序结果分析发现携带CLCN7(Y99C)突变的家系患者临床病征与国内、外已报道的CLCN7所致显性遗传石骨症一致。2.石骨症相关microRNA及其靶基因分析(1) microRNA测序共发现石骨症组和对照组显著差异表达的已知microRNA共123个，其中上调表达microRNA63个，下调表达microRNA60个；石骨症患者特有的新microRNA38个。(2) iTRAQ蛋白质组学分析发现显著差异表达蛋白173个，其中显著上调表达蛋白78个，显著下调表达蛋白95个。(3)关联差异表达microRNA、蛋白质以及StarBase预测得到的microRNA靶基因信息分析发现117对互为逆向表达且可能存在相互作用的microRNA/靶蛋白，其中Hsa-miR-320a和Arf1的表达水平以及它们之间的相互作用分别得到了RT-qPCR、Western blot以及双荧光素酶报告基因技术的验证。结论:CLCN7(Y99C)是中国显性遗传石骨症家系患者的致病基因突变位点，全外显子测序技术是高效的石骨症致病基因筛查新方法。石骨症患者PBMCs中存在大量显著差异表达的microRNA和蛋白质，microRNA通过调控其靶基因表达可能在石骨症病理过程发挥着重要的作用。