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非天然手性氨基酸（S）-2-环丙基甘氨酸具有广泛的生理活性,被广泛应用于多肽类似物的合成和新药开发,如大环饥饿激素受体拮抗剂、缓激肽B1受体拮抗剂、纺锤体驱动蛋白抑制剂,可用于抗菌、止痛、抗癌、抗惊厥和神经退行性疾病的治疗。因而发展（S）-2-环丙基甘氨酸有十分重要的学术价值和应用前景。目前用于（S）-2-环丙基甘氨酸不对称合成的方法主要有:化学法、拆分法和生物法。相比传统的化学合成法,生物催化合成路线绿色环保,成为具有潜力的合成方法。现有的生物催化不对称合成（S）-2-环丙基甘氨酸主要是通过酶偶联法来实现的,羰基还原胺化酶和辅酶再生酶在不同的菌体中表达,在催化过程中,底物、产物以及辅酶必须通过细菌细胞膜进行细胞内外的物质扩散以及细胞间的物质交换才能保证生物转化过程的进行,传质阻力使物质扩散及交换所需时间延长,催化效率下降。针对此情况,本课题拟利用基因工程技术,将表达羰基还原胺化酶的基因与表达辅酶再生酶的基因通过柔性连接子连接,形成具有羰基还原胺化活性和辅酶再生活性的单链多肽,从而实现在单细胞中表达具有双活性中心的双功能融合酶。实现羰基不对称还原胺化和辅酶原位再生同时进行并循环往复,提高生物转化效率,建立生物催化不对称合成（S）-2-环丙基甘氨酸绿色高效的新方法。具体内容如下:1.构建重组酶表达载体,诱导重组酶的表达并优化表达条件。选取来自Bacillus cereus和Thermoactinomyces intermedius的亮氨酸脱氢酶（Leucine dehydrogenase）Bc-LDH和Ti-LDH作为羰基还原胺化酶。选用来自Komagataella pastoris的甲酸脱氢酶（Formatedehydrogenase）Kp-FDH作为辅酶再生酶。全合成目标基因序列,再与空白载体pET28a相连,得到重组质粒pET28a-kpfdh、pET28a-bcldh和pET28a-tildh。利用基因工程技术将表达羰基还原胺化酶的基因和表达辅酶再生酶的基因的C-端或N-端分别与连接子相连,形成四种重组表达质粒pET28a-kpfdh-linker-bcldh（pET28a-klb）、pET28a-bcldh-linker-kpfdh（pET28a-blk）、pET28a-kpfdh-linker-tildh（pET28a-klt）和pET28a-tildh-linker-kpfdh（pET28a-tlk）,获得双功能酶基因。DNA测序分析和琼脂糖凝胶电泳分析结果表明重组质粒均成功构建。重组质粒转化感受态细胞,IPTG诱导目标蛋白表达,通过SDS-PAGE分析和酶活性测定,得到重组酶的优化表达条件,Kp-FDH:25℃、0.2 mM IPTG、48 h;Bc-LDH:25℃、0.2 mM IPTG、48 h;Ti-LDH:25℃、0.4 mM IPTG、24 h;KLB:16℃、0.6 mM IPTG、48 h;BLK:16℃、1.0 mM IPTG、48 h;KLT:16℃、1.0 mM IPTG、72 h;TLK:16℃、0.4 mM IPTG、48 h。2.表征重组酶的基本酶学性质。首先,考察温度对酶活性的影响,得到重组酶的最适温度。Kp-FDH、Bc-LDH、Ti-LDH的最适温度分别为70℃、60℃、70℃;KLB、BLK、KLT、TLK中辅酶再生酶亚基最适温度分别为70℃、70℃、60℃、70℃;羰基还原胺化酶亚基最适温度分别为70℃、60℃、40℃、40℃。其次,考察pH对酶活性的影响,确定重组酶的最适pH。Kp-FDH、Bc-LDH、Ti-LDH的最适pH分别为6.0-9.0、9.0、9.0;KLB、BLK、KLT、TLK中辅酶再生酶亚基最适pH分别为8.0、9.0、9.0、9.0;羰基还原胺化酶亚基最适pH分别为9.0、9.0、7.0、6.0。然后,考察重组酶的热稳定性。通过比较发现,相比单功能酶,双功能融合酶在高温时稳定性有所下降,但在低温4℃和25℃时,热稳定性没有明显的变化。结果表明,通过连接子连接后,并没有改变两个酶低温状态的热稳定性。最后,测定重组酶的动力学参数。Kp-FDH的Km、kcat和kcat/Km分别为10.15、75.38和7.42;Bc-LDH的Km、kcat和kcat/Km分别为0.62、1204.56和1953.11;Ti-LDH的Km、kcat和kcat/Km分别为2.35、920.93和391.39;KLB辅酶再生酶的Km、kcat和kcat/Km分别为9.65、14.61和1.51;羰基还原胺化酶的Km、kcat和kcat/Km分别为0.88、653.85和740.53;BLK辅酶再生酶的Km、kcat和kcat/Km分别为13.99、7.16和0.51;羰基还原胺化酶的Km、kcat和kcat/Km分别为1.28、350.11和272.75;KLT辅酶再生酶的Km、kcat和kcat/Km分别为11.97、4.46和0.37;羰基还原胺化酶的Km、kcat和kcat/Km分别为1.24、83.12和67.09;TLK辅酶再生酶的Km、kcat和kcat/Km分别为34.00、56.18和1.65;羰基还原胺化酶的Km、kcat和kcat/Km分别为0.33、95.76和290.11。相比融合前,第一组重组酶融合后的kcat/Km均大幅度减小,第二组重组酶融合后的kcat/Km均减小,但减小幅度没有第一组明显,由于kcat/Km没有明显的降低,所以连接子对重组双功能酶的催化活性没有明显的影响,所以可以将其用于生物催化。3.用于不对称合成（S）-2-环丙基甘氨酸的生物催化剂的筛选及条件优化。首先,从设定的六组催化剂E.coli-Kp-FDH+E.coli-Bc-LDH、E.coli-Kp-FDH+E.coli-Ti-LDH、E.coli-KLB、E.coli-BLK、E.coli-KLT和E.coli-TLK中筛选出催化活性最好的生物催化剂:E.coli-TLK。基于温度、pH、甲酸铵浓度和辅酶浓度对转化率的影响,优化得到E.coli-TLK催化不对称合成（S）-2-环丙基甘氨酸的最适条件:40℃、pH 8、辅底物甲酸铵和底物环丙基乙醛酸钾的摩尔比为10︰1、辅酶浓度为0.2 mM。通过基因重组技术构建了具有羰基还原胺化和辅酶再生的双功能酶,实现了一步完成羰基还原胺化和辅酶再生的生物转化过程,建立了生物催化不对称合成（S）-2-环丙基甘氨酸绿色高效的新方法。