自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）作为机体非常重要的免疫细胞，在机体的各项免疫功能中发挥着重要的作用。NK细胞能合成并且分泌多种细胞因子如穿孔素、颗粒酶等直接杀伤靶细胞，能与机体的抗原提呈细胞如树突状细胞(dendritic cells，DC)及免疫细胞如T细胞之间进行相互作用，参与机体免疫功能的调节，还可以通过细胞膜表面的CD16分子与抗体相结合，发挥抗体依赖的细胞毒（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）作用等。由此可知，NK细胞具有多种强有力的功效，因此，目前医学各界对其研究众多，主要包括以下几个方面:NK细胞的杀瘤活性，NK细胞的抗病毒感染能力，NK细胞的免疫治疗等。　　衰老是一种不可避免的自然现象，是指机体对社会环境和自身生理环境适应能力的进行性减退，从而逐渐趋向死亡。随着社会的进步，衰老人群的比例逐渐增加，因此，对延缓衰老的研究越来越多。然而，为了抗衰老的研究，如何成功的构建出与人类衰老相近的动物模型成为实验研究的关键。多项实验表明，由D-半乳糖构建的亚急性衰老大鼠模型能够较好的模拟出自然衰老，因此被广泛应用于科学实验研究中。　　我们参照相关文献报道及实验研究，采用基因工程处理过的K562细胞在体外诱导脐带血NK细胞进行培养扩增，获得大量高纯度的NK细胞;采用短时间内对大鼠连续颈部皮下注射大剂量D-半乳糖的方法构建亚急性衰老大鼠肝脏损伤模型，将实验中获得的大量高纯度NK细胞尾静脉输注入亚急性衰老大鼠体内，研究探索脐带血NK细胞在由D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠肝脏损伤中的作用，并探讨其可能的机制。　　目的:　　1.体外诱导NK细胞的大量扩增，观察不同时间NK细胞的数量及纯度，寻找细胞纯度及数量最佳的时间点;　　2.对实验中体外诱导培养扩增获得的NK细胞的一般活性其及杀瘤特性进行检测;　　3.探讨脐带血NK细胞在由短时间内连续颈部皮下注射相对大剂量的D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠模型肝脏损伤中的作用及可能机制。　　方法:　　1.脐带血NK细胞的培养:从健康足月产妇获取新鲜的脐带血，用淋巴细胞分离液采取梯度离心法从中分离出其中的单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)。将MNCs置于配置好的培养基中进行诱导培养，使脐带血中的NK细胞得到大量扩增。在不同的时间点观察细胞的一般状态，用流式细胞术检测分析所获得的细胞表面CD3、CD56两种分子的表达、细胞自身的凋亡情况及其对肿瘤细胞的杀伤作用。　　2.亚急性衰老大鼠模型的建立:将购得的20只成年健康雄性Wistar大鼠随机等分为2组，分别记为空白对照组(normal，N)、造模组(model，M)。对造模组大鼠连续颈部皮下注射D-半乳糖来构建实验所需的动物模型，空白对照组大鼠给予同等剂量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)。在造模过程中，观察两组大鼠的生存、饮食情况，毛色及体重变化等指标。造模结束后，检测两组大鼠的肝脏指数、胸腺指数等指标的变化，用生化检测试剂盒检测大鼠血液、肝脏组织中超氧化物岐酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)浓度，用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)观察大鼠肝脏组织细胞形态的变化，用Masson染色法观察大鼠肝脏组织发生纤维化的情况，用qRT-PCR来检测大鼠肝脏组织细胞中多种基因如Bax，Bcl-2等的表达，用Western-blot检测大鼠肝脏组织细胞中与血管形成相关的VEGFA，和VEGFR2蛋白的表达水平。　　3.脐带血NK细胞在由D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠模型肝脏损伤中的作用及其机制研究:将购得的20只成年健康雄性Wistar大鼠随机等分为2组，分别标记为对照组(control，C)、实验组(test，T)。由上述造模方法成功构建出动物模型，将实验中扩增培养获得的NK细胞以108/Kg大鼠体重的剂量，通过尾静脉输注入实验组大鼠，同时对照组大鼠输注等体积PBS，每周2次，共4次。注射结束1周后，用过量戊巴比妥钠腹腔注射的方法处死大鼠，称取大鼠完整的肝脏、胸腺等脏器湿重，计算并统计分析肝脏指数、胸腺指数等指标的变化，用生化检测试剂盒检测大鼠血液、肝脏组织中SOD酶活性和MDA浓度，用HE染色法观察大鼠肝脏组织细胞形态的变化，用Masson染色法观察大鼠肝脏组织纤维化的情况变化，用qRT-PCR来检测大鼠肝脏组织细胞中各种基因如Bax，Bcl-2等的表达，用Western-blot检测大鼠肝脏组织中与血管形成相关的VEGFA和VEGFR2蛋白的表达水平。　　结果:　　1.脐带血来源的单个核细胞，在体外经基因工程处理过的K562细胞和IL-2联合诱导培养下，可获得大量(108)高纯度(＞92％)具有杀伤活性的NK细胞。　　2.在短时间内对大鼠颈部皮下连续注射大剂量D-半乳糖，可成功构造出亚急性衰老大鼠肝脏损伤模型。　　2.1 与空白对照组相比，造模组大鼠在造模过程中毛发脱落明显，体型较瘦弱，行动迟缓，对锐物反应迟钝，体重明显减轻(P＜0.01)，造模过程中大鼠死亡1只;而空白对照组大鼠正常生长，无死亡。处死大鼠后，取出完整的肝脏及胸腺组织，及时称取湿重，计算并统计分析脏器指数的变化，发现肝脏指数增加(P=0.007)而胸腺指数降低（P=0.0043）。　　2.2 检测大鼠血液及肝脏组织中SOD酶活性及MDA水平，与空白对照组进行对比，发现造模组大鼠SOD酶活性明显降低（血液P=0.02，肝脏P＜0.01），而MDA水平明显增加（血液P=0.008，肝脏P=0.004）;　　2.3 肝脏组织HE染色:与空白对照组相比，造模组大鼠肝脏组织淤血，肝脏细胞明显水肿，嗜酸性变细胞明显增多，肝小叶中央静脉部分闭锁，周围肝索未呈放射状排列，排列紊乱，肝血窦扩张，炎症细胞浸润，肝脏中增殖细胞数目明显减少（通过双核细胞数目确定）（P=0.001），且细胞中可观察到脂褐素;　　2.4 肝脏Masson染色:造模组肝脏组织细胞蓝染区域较多，且颜色较深，纤维化较空白对照组严重;　　2.5 qRT-PCR检测:与空白对照组相比，造模组大鼠肝脏组织细胞中促凋亡基因Bax（P=0.0047）和Caspase-3的表达增加(P=0.0029)，而抑制凋亡基因Bcl-2(P=0.0018)和与血管形成相关的成纤维细胞生长因子FGF21（P=0.0039）的表达减少;　　2.6 Western-blot检测:与空白对照组相比，造模组大鼠肝脏组织细胞中与血管形成相关的VEGFA(P=0.045)和VEGFR2（P=0.0041）蛋白的表达减少。　　3.脐带血NK细胞在改善由D-半乳糖构造的亚急性衰老大鼠肝脏损伤中的作用及相应机制。　　3.1 与对照组进行比较，实验组大鼠饮食量及体重均有所增加（P=0.0053），毛发脱落等情况有所好转，麻醉处死大鼠后，取出完整的肝脏和胸腺，及时称取脏器湿重，计算并统计，比较出实验组大鼠肝脏指数降低(P=0.0273)而胸腺指数增加（P=0.0015）;　　3.2 NK细胞注射后的实验组大鼠的血液及肝脏组织中SOD酶活性较对照组明显升高（血液P=0.0049，肝脏P=0.0013）而MDA水平减低（血液P＜0.001，肝脏P=0.004）;　　3.3 HE染色:与对照组相比，实验组大鼠肝脏组织的淤血、细胞水肿、肝小叶中央静脉闭锁、周围肝索排列紊乱、肝血窦扩张、炎症细胞浸润等情况均有好转，嗜酸性变细胞减少，肝脏组织中增殖细胞的数目增加（P=0.0294）;　　3.4 Masson染色:实验组大鼠肝脏组织细胞中蓝染区域较少，且颜色较浅，纤维化较对照组稍有减轻;　　3.5 qRT-PCR检测:与对照组进行比较，实验组大鼠肝脏组织细胞中促凋亡基因Bax（P=0.0008）和Caspase-3（P＜0.001）的表达有所降低，而抑制凋亡基因Bcl-2（P=0.003）和与血管生成相关的成纤维细胞生长因子FGF21（P=0.0008）的表达增加;　　3.6 Western-blot检测:与对照组进行比较，实验组大鼠肝脏组织细胞中与血管形成相关的VEGFA(P=0.0006)和VEGFR2(P=0.0161)蛋白表达减少。　　结论:　　1.脐带血中单个核细胞在基因工程处理过的K562细胞和细胞因子IL-2联合培养下，在第15天达到NK细胞数量及纯度的最佳值。　　2.脐带血NK细胞具有较强的杀瘤活性，可以清除体内衰老凋亡等异常细胞;　　3.脐带血NK细胞可改善亚急性衰老大鼠模型的一般情况及肝脏损伤，可提高抑制衰老酶活性，降低促衰老物质水平，可以从基因、蛋白水平改善亚急性衰老大鼠肝脏损伤，可能是通过其分泌的因子、自身强大的杀伤活性等来实现的。