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丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKPs)是丝分裂原活化蛋白激酶(MPKs)活性和动力学的重要调节剂,它在植物的生长发育过程以及植物与环境互作过程中均起着重要作用。前人研究已表明UV-B辐射能促进拟南芥MKP1蛋白的累积,而且累积的MKP1能使UV-B活化的MPK3和MPK6脱磷酸化而失活；同时,本实验室前期的药理学和遗传学证据也表明MPK信号级联途径、过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)均参与了UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程。但是,目前关于MKP1及其靶蛋白MPK3和MPK6在UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭过程中的作用及其与信号分子H2O2和NO之间的相互关系却并不清楚。本实验以拟南芥野生型(Col-O)、mkp1、mpk3和mpk6的T-DNA插入纯合突变体(mkpl-1、mkpl-3、 mpk3、mpk6-1和mpk6-4)、NADPH氧化酶功能缺失双突变体(AtrbohD/F)和硝酸还原酶(NR)功能缺失双突变体(Nial/Nia2)的叶片为材料,借助气孔表型分析、激光共聚焦扫描显微镜技术、基因表达分析和激酶活性检测等方法,主要探讨了(1)MKP1在UV-B诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2和NO之间的相互关系；(2)MPK3和MPK6在UV-B诱导拟南芥气孔关闭中的作用及其与H2O2和NO之间的相互关系；(3)UV-B诱导MKP1基因表达的调控机制以及MKP1负调控UV-B诱导的气孔关闭的作用机制。本文得到的主要实验结果和结论如下：1.0.2-0.7 W·m-2的UV-B辐射均能诱导mkp1突变体气孔关闭,而野生型在0.5-0.7 W·m-2 UV-B辐射时气孔才有显著的关闭；0.5 W·m-2 UV-B辐射下mkp1突变体气孔关闭的速度和程度也明显大于野生型。说明蛋白磷酸酶突变体mkp1对UV-B辐射诱导气孔关闭的敏感性明显增强。0.5 W·m-2 UV-B辐射下拟南芥叶片MKP1基因表达量明显增高,暗示UV-B辐射促进了MKP1活性的升高。以上结果说明,UV-B辐射下MKP1活性的升高对UV-B诱导的气孔关闭起到了负调控作用,从而保证了UV-B辐射下气孔开度处在一个适宜的水平。2.mkp1突变体与野生型在可见光和0.5 W·m-2 UV-B辐射下,保卫细胞内源H2O2水平没有明显差异,暗示MKP1负调控UV-B诱导的拟南芥气孔关闭可能与H2O2的形成没有关系。3.在0.5 W·m-2UV-B辐射1-3h期间,mkp1突变体保卫细胞内源NO水平增高的速度和程度明显大于野生型,暗示UV-B辐射下MKP1活性的升高通过抑制保卫细胞NO的生成而负调节UV-B诱导气孔关闭的过程。4.与可见光对照相比,0.5 W·m-2 UV-B辐射处理明显促进了拟南芥野生型和mkp1突变体叶片MPK6和MPK3的磷酸化程度,但是mkp1突变体叶片MPK6和MPK3的磷酸化程度始终高于野生型,暗示MKP1负调控UV-B诱导气孔关闭可能是通过作用于其靶蛋白MPK6和MPK3使其脱磷酸化而失活来发挥作用。5.UV-B辐射能诱导拟南芥野生型和mpk3功能缺失突变体气孔关闭,但不能诱导mpk6功能缺失突变体气孔关闭,说明UV-B活化的MPK6是UV-B诱导气孔关闭的信号转导途径中的一个重要的正调控因子。UV-B辐射诱导拟南芥保卫细胞H2O2生成不能被mpk6突变所抑制,但UV-B诱导保卫细胞NO生成能被mpk6突变体抑制；外源H202处理不能诱导mpk6突变体气孔关闭,也不能逆转mpk6突变体在UV-B辐射下的气孔不关闭性,而外源NO处理不仅能诱导mpk6突变体的气孔关闭,也能逆转该突变体在UV-B辐射和外源H202处理下的气孔不关闭性。上述结果说明MPK6通过诱导保卫细胞NO的形成介导了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程。6.mkp1-1/mpk6-4双突变体在UV-B辐射下保卫细胞内源H202和NO的生成及气孔运动的表型与mpk6单突变体完全一致,即UV-B辐射能诱导该双突变体保卫细胞H202生成,但不能诱导其保卫细胞NO生成和气孔关闭,而外源NO处理能诱导其在可见光和UV-B辐射下的气孔关闭,该结果进一步证实UV-B辐射下MKP1负调控气孔关闭的作用是通过调节其靶蛋白MPK6的活性来实现的。7.UV-B辐射不仅能诱导拟南芥野生型叶片MPK3和MPK6的活化,也能诱导硝酸还原酶双突变体Nial/2和NADPH氧化酶双突变体AtrbohD/F叶片MPK3和MPK6的活化,而且两双突变体在UV-B辐射下MPK3和MPK6的活性均高于野生型,这与mkp1突变体的表型相一致；同时,基因表达分析结果显示UV-B诱导MKP1基因表达能被Nia1/2.AtrbohD/F和mpk6突变体抑制。上述结果表明UV-B辐射诱导形成的H2O2和NO以及活化的MPK6正向反馈诱导了MKP1的表达,而且UV-B诱导MPK3和MPK6的活化受该反馈机制活化的MKP1的负调控。结合本文和前人研究己表明的UV-B诱导保卫细胞NO形成依赖于H202的结果,我们可得出如下UV-B诱导气孔关闭的信号转导网络：UV-B辐射一方面诱导蛋白激酶MPK3和MPK6的活化,另一方面诱导保卫细胞H202的形成,活化的MPK6和形成的H202共同作用诱导保卫细胞NO的形成,形成的NO一方面诱导了气孔关闭,另一方面通过反馈方式诱导MKP1基因的表达使其活性提高,MKP1通过促进其靶蛋白MPK3和MPK6脱磷酸化的方式进而负调控了UV-B诱导的气孔关闭。