[背景和目的]透皮给药系统(Transdermal drug delivery system,TDDS)是一种理想的给药方式,具有广阔的市场前景。近年来,化学促渗剂、纳米技术、离子导入、超声、微针、射频或热消融等各种理化方法的引入,打开了生物大分子的透皮大门。然而,它们在帮助药物克服皮肤屏障功能,实现有效TDDS的同时,对皮肤产生的刺激和破坏也成为TDDS的主要问题。寻找既对皮肤刺激性小、又能帮助生物大分子透皮的方法,是经皮给药领域的一个难点。在本文研究中,我们选择创伤小、修复快、可控性好的点阵Er:YAG激光,探索了其对水溶性荧光抗体(四甲基异硫氰酸罗丹明-羊抗小鼠IgG,简称T-IgG,分子量约150kDa)的体内外透皮作用,拟实现有效、安全、可控的TDDS。[方法]以SD幼鼠(3-5d)背部皮肤为模型,我们采用经典Franz扩散法观察了24h中T-IgG透过点阵激光处理皮肤的体外透皮效应,并探索了不同点阵能量(0,12.5,25,37.5J/cm2)、点阵密度(0;5%,100孔/cm2;10%,210孔/cm2)及抗体浓度(0,0.5,1,2μg/ul)在不同时间点(2h、4h、6h、8h、20h、24h)对T-IgG透皮的影响。Western blot被用于评估T-IgG体外透皮24h后与小鼠IgG结合的生物活性。在体内透皮研究中,组织冰冻切片与共聚焦显微镜被分别用于观察T-IgG活体透皮2h、4h、6h、24h后在SD幼鼠皮肤矢状面及冠状面中的分布,以探索点阵激光介导T-IgG的透皮途径。[结果]SD幼鼠皮肤的组织病理显示：角质层、活性表皮层、真皮及皮下脂肪层分别约为20-40μm、30-50μm、80-100μm、90-150μm,皮肤总厚度约300-400μm；以12.5,25和37.5J/cm2三种点阵激光能量处理SD幼鼠皮肤后,可分别形成约50μm、100μm和150μm深的微孔道。在整个24h体外透皮试验中,T-IgG在完整皮肤对照组(未经激光处理组)中的累积透皮量分别为0.282士0.013(2h),0.353±0.018(4h),0.430±0.029(6h),0.522±0.027(8h),0.746±0.108(20h)和0.748±0.083μg/cm2(24h)；PBS对照组中的累积透皮量(透过物多为皮肤组织中的非特异蛋白)分别为0.213±0.021(2h),0.278±0.011(4h),0.342±0.039(6h),0.402±0.048(8h),0.581±0.032(20h),0.665±0.027μg/cm2(24h). T-IgG在完整皮肤对照组中的24h累积透皮量与PBS对照组间无统计学差异(p>0.05),而与点阵激光处理组间有显著性差异(p<0.001)。随着点阵能量的升高,24h内T-IgG透皮量亦随之增加,且增加幅度以透皮后期明显。点阵能量为12.5,25和37.5J/cm2时的T-IgG累积透皮量(10%点阵密度,2μg/μl T-IgG15μl)分别为0.755±0.142vs.1.211±0.139vs.1.192±0.372(2h,P>0.05)；1.769±0.419vs.2.345±0.398vs.2.157±0.411(4h,P>0.05)；2.430±0.275vs.2.795±0.621vs.3.152士0.927(6h,P>0.05);2.841±0.295vs.3.189±0.454vs.4.299±1.629(8h,P>0.05)；4.179±0.873vs.6.224±0.273vs.7.985±1.613(20h,P<0.001)；4.688±1.413vs.6.367±0.215vs.8.330±1.876μg/cm2(24h,P<0.001).高能量组(37.5J/cm2组)与低能量组(12.5J/cm2组)间的透皮量在透皮后期(20h、24h)出现统计学差异,而在透皮8h前无统计学差异。当固定点阵能量为25J/cm2、T-IgG浓度为2μg/μm时,10%点阵密度组与5%点阵密度组的累积透皮量分别为0.610±0.034vs.1.211±0.139(2h,P<0.05),1.128±0.077vs.2.345±0.398(4h,P<0.001),1.789±0.087vs.2.795±0.621μg/cm2(6h,P<0.001),2.124±0.115vs.3.189士0.454(8h,P<0.001),4.997±0.335vs.6.224±0.273(20h,P<0.001),6.217±0.198vs.6.367±0.215μg/cm2(24h,P>0.05)。即随着点阵密度的增加,T-IgG透皮量亦随之增加,且增加幅度以透皮早期(8h前)明显,8h后,增加幅度减小,24h时趋于饱和。当固定点阵能量和点阵密度(25J/cm2,10%),T-IgG的加样浓度从0.5μg/μl增至2μg/μl时,T-IgG累积透皮量分别为0.656±0.266vs.1.211±0.139(2h,P>0.05),0.791±0.146vs.2.345±0.398(4h,P<0.001),0.998±0.188vs.2.795±0.621(6h,P<0.001),1.107±0.167vs.3.189±0.454(8h,P<0.001),1.914±0.666vs.6.224±0.273(20h,P<0.001)和2.439±0.804vs.6.367±0.215μg/cm2(24h,P<0.001).与0.5μg/μl浓度组相比,2μg/μl组的T-IgG透皮量在透皮早期和透皮后期均呈显著性增加。经蛋白电泳(Western blot)进一步分析,透皮24h后的T-IgG仍具有与鼠IgG结合的生物活性。体内透皮试验中,T-IgG(2μg/μl,15μl)在完整皮肤对照组中透皮2h、4h、6h及24h后,共聚焦分层扫描及冰冻切片中均未见荧光信号。在点阵激光处理组(25J/cm2,10%,2μg/μl T-IgG15μl),体内透皮2h后,共聚焦分层扫描及冰冻切片中亦未见明显T-IgG荧光；4h后,点阵激光处理皮肤产生的微孔道中出现红色荧光；6h后,荧光信号增强,并有向微孔道周围弥散的趋势；透皮24h后,T-IgG在共聚焦分层扫描荧光图中的穿透深度约150μm(到达SD幼鼠真皮层),皮肤中见弥散的红色荧光,且以毛囊处明显。与此同时,24h后,大部分在6h前清晰可见的点阵激光产生的微孔道已修复闭合,在冰冻切片及共聚焦荧光图中仅见到极少数模糊的微孔。[结论]点阵Er:YAG激光能帮助150kDa的抗体大分子实现安全、有效、可控的透皮给药,通过调控点阵激光密度、能量和抗体浓度,可分别实现透皮早期、后期和全程抗体透皮量增加。点阵Er:YAG激光介导抗体分子的透皮途径与其在皮肤中产生的微孔道相关。这种安全可控的TDDS将为未来无创诊断及生物靶向治疗提供理论基础和研究方向。