许多研究表明,铅对全身各系统和器官均有毒性作用,主要是神经、心血管系统、骨代谢。铅可以通过对钙磷代谢、骨钙素、内分泌系统等的影响,干扰了骨形成,造成功能性的衰退,引起独特的疾病类型或病理性的改变。成骨细胞是骨形成细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化,对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关键作用。体外分离培养高纯度、活力强的成骨细胞是毒理学研究的基础。本试验在建立体外分离培养新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞基础上,研究铅对成骨细胞毒性的机理,为探讨铅对正常骨生理功能的影响,提供了一定的理论依据。1.成骨细胞的分离培养与鉴定采用改良的二次酶消化法获得大鼠颅盖骨成骨细胞,待细胞融合成单层后传代。倒置显微镜下观察成骨细胞的形态及生长情况,BCIP/NBT酶底物显色试剂盒和茜素红矿化结节染色鉴定成骨细胞。结果,此法分离的成骨细胞生长状态良好,纯度较高。2.铅对成骨细胞形态与增殖及分化的影响为观察铅对成骨细胞增殖及分化的影响,添加了不同浓度的铅溶液(0、20、40、80μmol/L)作用成骨细胞24h。倒置显微镜观察成骨细胞形态结构的变化,MTT测定成骨细胞增殖,PNPP法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性。结果显示,对照组成骨细胞生长旺盛,结构特征典型;与对照组比较,铅溶液浓度80μmol/L时,细胞毒性加重,细胞多崩解。成骨细胞增殖和ALP活性随着铅浓度的增加逐渐降低。各染毒组成骨细胞的增殖和ALP活性,均差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01);说明,一定量的铅可以导致成骨细胞的形态结构受损,降低成骨能力。3.铅对成骨细胞钙调蛋白含量的影响为了解铅对成骨细胞钙调蛋白含量的影响,通过添加不同浓度的铅溶液(0、20、40、80μmol/L)作用成骨细胞24h。结果显示,与对照组比较,铅的染毒浓度20μmol/L时,成骨细胞钙调蛋白的mRNA和蛋白表达减少;铅的染毒浓度≥40μmol/L时,成骨细胞钙调蛋白的mRNA和蛋白表达量明显增加。总体趋势表明铅在一定浓度范围内能引起成骨细胞的钙调蛋白的mRNA和蛋白表达增加。4.铅对成骨细胞磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)的影响通过加入不同浓度的铅溶液(0、20、40、80μmol/L)培养成骨细胞24h,研究铅对成骨细胞PC-PLC的影响。结果表明,各不同浓度的铅溶液导致成骨细胞PC-PLC活性下降和磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C蛋白量表达降低,与对照组比较,差异极显著(P<0.01)。表明一定浓度的铅会导致成骨细胞PC-PLC活性降低,对成骨细胞的PC-PLC蛋白表达量表现为不同程度的抑制作用。