【摘 要】
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水苏糖是豆类等食物中广泛存在的非还原性功能性低聚糖。相关研究表明,水苏糖能够高选择性促进双歧杆菌增殖,靶向性改善肠道健康。为验证小肠上皮细胞分泌的microRNA是否参与了水苏糖调节肠道菌群这一过程,本研究利用16S rDNA测序技术和Small RNA测序技术系统考察水苏糖对小鼠肠道菌群结构和小肠microRNA表达的影响,筛选水苏糖干预诱导的丰度显著改变的肠道细菌和表达量显著改变的microR
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水苏糖是豆类等食物中广泛存在的非还原性功能性低聚糖。相关研究表明,水苏糖能够高选择性促进双歧杆菌增殖,靶向性改善肠道健康。为验证小肠上皮细胞分泌的microRNA是否参与了水苏糖调节肠道菌群这一过程,本研究利用16S rDNA测序技术和Small RNA测序技术系统考察水苏糖对小鼠肠道菌群结构和小肠microRNA表达的影响,筛选水苏糖干预诱导的丰度显著改变的肠道细菌和表达量显著改变的microRNA,进一步通过构建PLSR偏最小二乘回归模型对筛选出的microRNA和肠道细菌进行相关性预测,最后利用流式细胞术以及微生物体外培养发酵技术对预测结果进行验证,主要研究内容及结果如下:（1）水苏糖干预10周后小鼠体重正常、摄食量稳定,对正常小鼠和水苏糖干预下小鼠的盲肠内容物进行16S rDNA测序后我们发现,水苏糖干预小鼠的肠道内微生物多样性、物种分布及聚类方式发生了明显改变。进一步对测序结果进行筛选得到8种丰度显著改变的细菌,即Lactobacillus gasseri、Bacteroides acidifaciens、Bacteroides vulgatus、Ruminococcus flavefaciens、Parabacteroides goldsteinii、Lactobacillus murinus、Lactobacillus alimentarius 和 Akkermansia muciniphila。在此基础上,我们优先选取被多项研究证实具有肠道益生作用且被水苏糖促增殖的 Lactobacillusgasseri、Lactobacillus alimentarius 和 Akkermansia muciniphila进行后续验证性实验。（2）采用Small RNA测序技术对正常小鼠和水苏糖干预小鼠的小肠microRNA表达谱进行分析发现,水苏糖显著改变小鼠小肠组织中27种microRNA的表达水平。同时,使用qPCR技术进一步验证小肠组织及粪便中这27种差异表达microRNA的水平。在此基础上,结合TPM、P value和FDR值筛选出9条在Small RNA测序和qPCR验证结果中表达变化趋势一致的microRNA,其中大多数microRNA呈现下调趋势。（3）以水苏糖诱导的丰度显著改变菌属为因变量,以表达显著变化小肠microRNA为自变量,成功构建PLSR偏最小二乘回归模型,结果显示:三种肠道益生菌 Lactobacillus gasseri、Lactobacillus alimentarius 和 Akkermansia muciniphila与多种差异microRNA水平呈现显著相关关系。综合这三种微生物在属水平和种水平的相对丰度以及小肠和粪便中microRNA的表达情况,我们发现被水苏糖下调的miR-133b-3p和miR-3068-5p与这三种益生菌的丰度显著相关,推测其可能参与介导水苏糖对肠道中Lactobacillus gasseri、Lactobacillus alimentarius 和 Akkermansia muciniphila 的生长调控。（4）将化学合成的荧光标记microRNA与肠道细菌共培养后,利用流式细胞术监测细菌菌体内荧光强度发现:荧光标记的miR-133b-3p和miR-3068-5p均能进入 Lactobacillus gasseri、Lactobacillus alimentarius和Akkermansia muciniphila菌体内。此外,细菌生长曲线测定结果显示,miR-133b-3p可显著抑制Lactobacillus gasseri的体外增殖。综上所述,水苏糖干预显著增加小鼠肠道内Lactobacillus gasseri等益生菌丰度,同时改变小肠组织中miR-133b-3p等microRNA的表达,PLSR预测结果联合共培养验证结果显示,miR-133b-3p显著抑制Lactobacillusgasseri增殖。由此我们得出结论:水苏糖通过下调小肠内靶向抑制Lactobacillus gasseri生长的miR-133b-3p的表达,定向增加肠道益生菌Lactobacillus gasseri的丰度,从而改善小鼠肠道菌群结构。
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