论文部分内容阅读
目的:分析肝癌组织中RASSF1A的表达趋势及乙肝病毒（Hepatitis BVirus，HBV）的关键基因HBx对RASSF1A的表达影响。 方法:应用RT-PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR(Fluorescent Quantitative RT-PCR)方法，在RNA水平分析了肝癌病例组织、正常肝永生化细胞系和肝癌细胞系中抑癌基因RASSF1A的表达情况。应用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)方法分析了RASSF1A在细胞中的表达部位。在HBx表达载体转染的正常肝永生化细胞系L02、肝癌癌旁细胞系QSG-7701和肝癌细胞系SMMC-7721中，应用RT-PCR方法检测了RASSF1A在HBx转染前后的表达变化。以DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza处理表达HBx的肝癌细胞系MHCC-97H，检测DNA甲基化作用是否参与调控了RASSF1A的表达。运用甲基化特异性PCR(Methylated Specific PCR，MSP)方法检测了HBx转染前后L02和QSG-7701细胞系RASSF1A基因的启动子区DNA甲基化情况。用RT-PCR的方法检测了稳定转染DNMT1 siRNA和DNMT3B siRNA的肝癌细胞系SMMC-7721中RASSF1A的表达情况，以确认何种DNA甲基转移酶了参与了RASSF1A的表达调控。应用亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite Genomic Sequencing，BGS)分析抑制DNMT1后RASSF1A启动子区CpG位点的DNA甲基化程度。 结果: RASSF1A在肝癌组织和肝癌细胞系中呈表达下调趋势。在肝癌组织中，RASSF1A在RNA水平的低表达率为48％。免疫组织化学的结果显示，RASSF1A在肝细胞核中表达。在转染了HBx表达载体的正常肝永生化细胞系L02，肝癌癌旁细胞系QSG-7701和肝癌细胞系SMMC-7721中，HBx的转染下调了RASSF1A的表达，同时，DNMT1和DNMT3B表达上升。以5-Aza处理表达HBx的细胞系MHCC-97H，RASSF1A的表达回复，提示DNA甲基化参与调节RASSF1A的表达。HBx转染没有改变RASSF1A启动子区DNA甲基化状态，但影响了个别CpG位点的甲基化程度。HBx上调了肝癌细胞中DNMT1和DNMT3B，而抑制DNMT1诱导了RASSF1A表达，提示HBx抑制RASSF1A的表达可能与DNMT1有关。 结论:通过以上实验研究，初步得到以下结论: 1.肝癌组织及细胞系中，抑癌基因RASSF1A呈低表达趋势。 2.HBV关键基因HBx的转染抑制了肝细胞系中RASSF1A的表达。 3.DNMT1 siRNA使RASSF1A的表达回复，提示DNMT1可能一定程度地参与了RASSF1A基因的表达调控。