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目的:目前,有关混合DNA(DNA mixture)分析、结果解释(DNAmixture interpretation)的方法以及衍生出的软件分析系统主要是基于短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)可变长度多态性的毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)分离技术。然而,这一主流STR分型技术的结果对混合斑DNA的解释提出了难题,主要是由于STR基因座中复合序列(compound repeats)和/或复杂序列(complex repeats)的存在导致CE分离技术无法得到STR基因座的全序列信息。而当前快速发展的新一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)不仅能够通过产出高覆盖率深度测序的不同分型丰度(reads数)从而保证了STR基因座各等位基因的高概率精确判断的严谨性,还能够获得STR等位基因间的核苷酸差异(nucleotide variation)信息—单核苷酸多态性(SNPs),增加了混合DNA分析中的关键要素使得反解混合样本的概率模式简便高效化。本研究选用Amp FLSTR®Identifiler®体系中的15个常染色体STR,应用NCBI-primer-blast、primer premier5.0、Oligo7设计各基因座引物,使得各基因座PCR目标产物恰当分布在900~1500bp之间,且体系内产物浓度比控制在1:4之内,通过片段分析技术(fragment analysis,FA)直观、准确的检测片段长度,旨在建立一种对较长片段(1000~1500bp)多重PCR产物进行高分辨率(1%)分离的片段分析方法,将以上15个STR基因座分成2组分别构建成2个PCR多重扩增体系以适用于新一代测序平台对混合DNA高效便捷准确的分析,并对该复合分型体系的混合DNA分析价值进行初步评价。方法:①选用具有个体识别效能的Amp FLSTR®Identifiler®体系中的15个常染色体STRs基因座(D8S1179,D21S11,D7S820,CSF1PO,D3S1358,TH01,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,VWA,TPOX,D18S51,D5S818,FGA),根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore公布的参考序列,应用引物设计网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/以及引物设计软件primerpremier5.0、Oligo7设计15个STRs的PCR引物,并使各个基因座PCR目标片段恰当分布在900~1500bp范围内,各片段大小差异在18~104bp之间。②构建STRs多重PCR反应体系:使用Platinum®Multiplex PCRMaster Mix(ABI)合理调整体系内引物及引物浓度,使得分为2个多重扩增体系PCR产物分别经Fragment Analyzer?Automated CE System(AATI)片断高分辨率分离检测,PROSize®data analysis software收集数据并分析结果。优化退火温度、循环次数以及各基因座引物浓度比例等因素,使各基因座PCR产物量控制在1:4范围内,最终构建成STRs复合分型体系。③应用构建的STRs复合分型体系扩增已知STR分型的女性(9947A)和男性(2800、007)control DNAs(Promega)构建的混合DNA实验模型,通过Illumina®Mi Seq®System测序仪进行碱基读取以此验证并评价该体系中引物的特异性以及在混合DNA分析中的初步应用价值。结果:1 15个常染色体STRs复合分型体系15个基因座分配到2个PCR反应体系内分别同时扩增8个和7个STRs基因座的DNA片段,片段长度在900~1500bp之间。FA检测结果显示,各组内每个基因座均出现与单一扩增FA检测片段大小匹配的目标片段,无明显影响主峰的非特异性杂峰,各片段浓度差异在4倍范围内。2 Miseq平台对引物特异性验证以及体系在混合DNA新一代测序分析的初步应用价值评价测序结果显示,该多重PCR体系在单一样本中能够良好的进行15个常染色体基因座扩增,在基因组匹配中没有其他非目的基因座的扩增子。而在混合样本的测序分析结果中除去一些主要组分上出现的sttuter等位基因可以利用后期合并和过滤消除其影响可不考虑外,各基因座等位基因分布整体上符合预期,但是出现了次要组分个别基因座的等位基因失衡以及1个等位基因丢失的现象。结论:1本研究通过自主设计PCR引物,成功构建了2个平行的、扩增片段长度在1000bp左右的包含15个常染色体STRs基因座的复合分型体系,为应用新一代测序技术研究法医学混合DNA分离的个体识别新方法提供基础。2该复合分型体系能够通过高通量测序良好的检测单一样本等位基因分型,而混合样品经该体系扩增后的Miseq测序结果整体上可以进行个人识别等位基因分型,但是仍需进一步优化改进。