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背景目前,基于荧光标记的聚合酶链式反应-毛细管电泳（polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE）技术用于短串联重复序列（short tandem repeat,STR）遗传标记的分型仍是法医科学领域的主流技术。但是,基于PCR-CE技术的STR分型仅能分析STR遗传标记的长度多态性,长度相同但序列不同的STR等位基因被分型为相同的等位基因;另外,PCR-CE分型技术还会因电泳漂移等因素产生多种干扰峰如off-ladder峰,进一步影响STR等位基因的分型结果。二代测序技术（next generation sequencing,NGS）用于STR遗传标记分型,不仅能分析其长度多态性,更重要的是能够对长度相同但序列不同的STR等位基因进行分型,从而获得更多的遗传多态信息;除此之外,由于NGS直接对序列进行分析通常可以避免因电泳漂移等因素产生的干扰峰。目的本实验以河南汉族群体为研究对象,选择1个常染色体STR基因座—D8S1179和2个快速突变多拷贝Y-STR基因座—DYF404S1a/b（2拷贝）及DYF399S1a/b/c（3拷贝）采用NGS分型。首先,使用NGS技术对D8S1179基因座进行分型,探索并建立NGS用于STR遗传标记分型的条件和方法;同时,结合NGS及PCR-CE技术对2个多拷贝Y-STR基因座进行分型研究,并对比两者分型结果,以期获得STR基因座更多的遗传多态性信息,从而为NGS应用于法医学实践和人类遗传学研究提供技术支持和基础数据。方法1.样本的采集及全基因组DNA提取:在知情同意的情况下,采集河南汉族人群无关男性个体血液样本225例;阳性标准品DNA采用9947A（女性）和9948（男性）两种,超纯水作为阴性对照标准。采用饱和酚-氯仿法提取基因组DNA。2.荧光扩增及PCR产物毛细管电泳技术分型:DYF404S1、DYF399S1基因座标记6-FAM荧光染料（蓝色）,PCR产物采用ABI3130XL遗传分析仪进行分离,等位基因通过GeneMapperID v3.2软件分型。3.等位基因命名及分型标准物制备:分别对3个STR基因座的不同等位基因进行序列分析,根据国际法医遗传学会（ISFG）推荐的原则进行等位基因命名。等位基因分型标准物的制备采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳-胶回收法。4.二代测序引物设计及测序文库构建:使用primer 5软件设计3个STR基因座特异性引物,在特异性引物两端加上接头。NGS引物合成后通过PCR、琼脂糖凝胶电泳实验验证引物有效性,最终DYF404S1、DYF399S1基因座各得到25对NGS引物;D8S1179基因座得到132对NGS引物。使用BIOO RAPID DNA基因组建库试剂盒进行NGS文库构建,构建完成的文库进行定量和质检。5.二代测序及测序数据分析:NGS文库使用Illumina MiseqTM系统测序,测序完成后得到NGS测序结果原始数据,依靠样本引物中的接头序列辨别、区分每个样本DNA序列。使用基于Linux系统的STRait Razor V2.0软件对每个样本进行等位基因分型。运行STRait Razor之前,录入DYF404S1、DYF399S1、D8S1179基因座等位基因配置文件。基因座等位基因配置文件包括:基因座名称、基因座所在染色体、正向5’端侧翼和3’端侧翼序列、反向5’端侧翼和3’端侧翼序列、核心正反向序列、等位基因及其对应片段大小。6.统计学分析:采用直接计数法分析计算等位基因频率和单倍型频率,法医学应用参数:基因多样性（GD）、个体识别力（DP）、非父排除率（PE）、单倍型多样性（HD）及杂合度（heterozygosity）等。结果1.PCR-CE技术用于河南汉族225例无关男性个体DYF404S1、DYF399S1、D8S1179 3基因座分型。DYF404S1、DYF399S1分别为2拷贝和3拷贝Y-STR基因座。DYF404S1基因座在河南汉族群体中等位基因变化范围为1118,共观察到28种基因型,出现最多的是14/15,占11.9%,其中3例样本出现等位基因异常分型,均表现为3等位基因模式;基因多样性（GD）和个体识别力（DP）分别为0.9408和0.9389。DYF399S1基因座单体型有94种,等位基因范围为1222,其中出现最多的单体型为18/18/18,GD和DP值分别为0.9879和0.9860。D8S1179基因座等位基因范围为917,共26种基因型,杂合度为0.8928,DP为0.8491。2.使用NGS对3个基因座进行等位基因序列分析。先采用引物两端添加接头的技术探索NGS用于D8S1179基因座等位基因的分型方法,以9948为阳性标准品DNA验证NGS分型STR基因座的灵敏度,同时对100例无关男性个体采用NGS分型,结果100例样本全部分型成功。根据建立的NGS用于STR遗传标记的分型条件和方法对DYF404S1基因座等位基因分型,河南汉族225例无关男性个体中220例成功分型,分型成功率为97.8%,而且其分型结果与基于CE技术的分型结果一致。但是,DYF399S1 NGS分型失败,可能与基因座片段太长有关。3.DYF404S1基因座等位基因异常分型,河南汉族225例无关男性个体中检测到3例样本出现等位基因异常分型,均表现为3等位基因模式,异常分型概率为1.3%,2例样本CE分型图谱表现为等位基因的峰高及峰面积大致相同,1例样本表现为一个峰的峰高及峰面积约等于另外两个峰之和。结论1.分析DYF404S1、DYF399S1、D8S1179 3基因座在河南汉族群体中的遗传多态性,可以为法医学实践和人类遗传学研究提供基础数据。2.使用引物两端添加接头的方法对DYF404S1、D8S1179基因座进行NGS文库构建,并成功分型,建立的NGS技术分型多拷贝Y-STR及常染色体STR基因座方法,可运用于法医学实践,且灵敏度高。3.发现了DYF404S1a/b基因座在河南汉族群体中出现等位基因异常分型,均表现为3等位基因模式。