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聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基互补配对形成的双链RNA,是一种高效干扰素诱导剂。本研究利用国产原料首先对聚肌胞的合成条件进行了优化,探讨了影响聚肌胞结构稳定性的因素。为探讨聚肌胞对特异性免疫的影响,本文研究了新城疫免疫前后不同时间应用聚肌胞对雏鸡抗体水平的影响。为探讨聚肌胞在鱼类中的抗病毒作用,研究了聚肌胞对患有淋巴囊肿病毒病牙鲆的初步疗效;探讨了聚肌胞的抗病毒机制,实验进一步对聚肌胞不同用药途径诱导大菱鲆抗病毒蛋白Mx转录水平的时相变化以及血液天然免疫相关指标的变化进行了较深入的研究。研究结果如下:
1.聚肌苷酸与聚胞苷酸合成聚肌胞的最适条件为:磷酸缓冲液(pH7.2)或Tris-HCl缓冲液(pH7.2)可以提供聚肌胞稳定的pH环境,聚肌苷酸和聚胞苷酸在45℃条件下退火,并在100℃煮沸灭菌30min后采取水流迅速降温复性形成的聚肌胞减色效应显著,适当增加金属离子(Na+,Ca2+)溶液的浓度可以增强聚肌胞结构的稳定性。聚肌苷酸受Na+的影响显著并且可以被溴化乙啶染色,表明聚肌苷酸溶液具有自身可以配对形成双链的结构特点;聚胞苷酸不具备双链结构的特点;Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Na+在一定浓度范围内可以明显提高聚肌胞双链的结合紧密度,而Cu2+对聚肌胞双链结构具有破坏作用;硫酸卡那霉素和钙离子可以保护聚肌胞抵抗RNA酶迅速降解的作用;实验发现了不同动物的血清中RNA酶活性对聚肌胞的降解作用有差异,其中,鸡血清对聚肌胞的降解最明显,而兔血清对聚肌胞降解不明显;聚肌胞的琼脂糖凝胶电泳发现,聚肌胞的迁移率与100bp的Marker基本一致,Ca2+和硫酸卡那霉素对聚肌胞的电泳迁移率没有影响。聚肌胞的性质及其稳定性的研究为开发价廉有效的新型抗病毒药物提供了工艺参数基础。
2.聚肌胞联合新城疫疫苗可以提高雏鸡血清中的免疫抗体滴度。免疫之前48h、24h和12h注射polyI:C,雏鸡血液中抗体效价仅在10日龄明显升高;免疫新城疫疫苗的同时及免疫之后12h、24h注射polyI:C,9~12日龄雏鸡血清抗体滴度均明显提高。PolyI:C可以提高雏鸡免疫抗体滴度,对由弱毒苗刺激的免疫反应具有调理作用。实验结果为干扰素诱导剂与弱毒疫苗的联合应用提供了重要的试验参考。
3.本研究利用聚肌胞对患有淋巴囊肿病毒病的牙鲆进行了初步治疗,发现聚肌胞能够抑制淋巴囊肿病毒复制。聚肌胞对轻度患病牙鲆治疗的10日内发现,仅1尾牙鲆死亡,其中10尾鱼的较大肿瘤有明显脱落现象;而对患病较重的牙鲆治疗后发现,囊肿脱落效果不明显,但囊肿也不增多,死亡率为16%左右,对照组死亡率达到40%。对患有淋巴囊肿病毒病的牙鲆组织器官的石蜡切片显示,囊肿块内具有明显的肥大细胞;在肉瘤根部的上皮组织内发现了许多比正常上皮细胞大数十倍的肥大细胞;鳃丝部位有明显颗粒状聚集体,疑似病毒包涵体聚集体。本实验首次使用聚聚肌胞在水产养殖上进行临床应用,并取得了一定的治疗效果,这将为困扰了水产业多年的病毒病的治疗提供依据。
4.聚肌胞腹腔注射,浸泡和投喂等三种用药方式对大菱鲆血清中的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶活性有一定的影响,对血清溶菌酶活性的影响不显著,注射聚肌胞后大菱鲆血液细胞中的白细胞比例有升高趋势,但与用药前相比差异不显著。在分子水平上,本试验利用软件对大菱鲆Mx基因进行了分析,利用Mx基因保守区自行设计的引物扩增片段特异性较高,初步建立了半定量RT-PCR法检测Mx基因的表达;三种用药途径诱导Mx转录水平的时相变化发现,三种途径均能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,一般在48h之后达到转录高峰,而且浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,在120h时仍然显著高于对照,而注射和投喂途径在96h有下降趋势。实验首次从Mx基因转录水平上检测聚肌胞诱导干扰素的效果,这不仅提供了检测Mx基因转录时相变化的方法,更为鱼类干扰素系统提供了理论上的补充,具有重要理论和实际意义。