利用拟南芥cDNA文库筛选PIPE和DELLA互作蛋白的研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:peterstone138
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GA作为一类重要的植物激素,影响着植物生长发育的诸多环节,包括种子萌发、茎伸长、叶扩展、花发育以及花粉成熟等。DELLA蛋白属于转录因子GRAS家族,是GA信号通路中重要的负调控因子。DELLA蛋白通过抑制GA响应基因的表达抑制GA信号转导。为了寻找GA信号通路中与DELLA蛋白互作的调节因子,本文选用DELLA蛋白家族成员RGA和GAI为诱饵进行cDNA文库筛选。由于RGA和GAI全长具有较强的自激活性,因此将RGA和GAI分段:RGAΔN 200-587氨基酸残基,RGAΔC 1-408氨基酸残基,GAIΔN 154-532氨基酸残基和GAIΔC 1-264氨基酸残基,分别构建表达载体。检测发现,仅有RGAΔN和GAIΔN不具有自激活性,能用于后续的文库筛选。RGAΔN阳性克隆17个,GAIΔN阳性克隆114个。对阳性克隆进行分析,这些基因编码的蛋白参与了叶绿体发育、细胞骨架组装和蛋白质降解等植物生长发育的诸多方面。此外还有一些功能未知的蛋白。由于DELLA蛋白可能受到蛋白磷酸化/去磷酸化调控,甄选出两个候选基因,分别为AT3G21222和AT5G22750。它们分别编码了一种蛋白激酶,其中AT3G22750属于MAPK家族。进一步双杂验证表明AT3G21222和AT5G22750与GAIΔN确实存在相互作用。为了深入研究AT3G21222和AT5G22750在植物生长发育中的重要作用及其与DELLA的相互关系,我们对相应的T-DNA插入株系进行了初步的表型鉴定,结果表明三个株系均没有明显的突变表型。此外还对SALK-038064进行GA3处理,测量其下胚轴和根长,结果表明,该株系对GA3的敏感程度略低于野生型。为了寻找PIPE可能参与的信号转导通路,本文还以PIPE为诱饵筛选cDNA文库,结果得到104个阳性克隆,经甄选得到一个候选基因ADFx。该基因编码的蛋白在细胞微丝骨架的组装中起到了很重要的作用。
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