氧化应激是机体在遭受有害刺激时,体内活性氧产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,导致多种形式组织损伤的过程。本研究首先利用过氧化氢(H2O2)诱导的仔猪肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cell-1,IPEC-1)氧化应激模型筛选出一株抗氧化功能较好的芽孢杆菌菌株——解淀粉芽孢杆菌SC06。随后通过动物试验研究了 SC06对仔猪生长、肠道抗氧化状态和自噬水平的影响,并通过研究SC06对IPEC-1的保护作用,揭示了 SC06改善机体抗氧化功能的作用机理,最后用高脂日粮诱导小鼠氧化应激和脂肪肝,以探究SC06改善小鼠氧化应激、肝脏脂肪变性和心理福利的作用,初步揭示SC06调控宿主抗氧化能力和提高动物健康水平的分子机理。本研究共包括以下5部分试验:试验一体外氧化应激模型的建立及具抗氧化功能芽孢杆菌的筛选(1)IPEC-1氧化应激模型的建立:采用不同浓度H202处理IPEC-1不同时间,IPEC-1细胞活力测定结果显示:当用300 μmol/L H2O2处理细胞12h时,细胞活力下降一半。概率单位法计算结果为,当用H202处理细胞12h时,H2O2的半数致死剂量为323.59μmol/L。因此,后续试验可用300 μmol/LH202处理细胞12 h以诱导氧化应激。(2)IPEC-1氧化应激指标的筛选:使用300 μmol/LH202分别处理细胞0、1.5、3、6、9、12和18 h,处理结束后测定多种抗氧化和凋亡相关基因的表达。结果显示:在所有测定的基因中,人血红素加氧酶基因(hemeoxygenase,HO-1)对H202的刺激最敏感。通过相关性分析,发现/HO-1的基因表达和H202的处理时间呈正相关(R2=0.9641)。所以,在本试验中,/HO-1基因的表达可用作IPEC-1氧化应激的主要指标,而其他抗氧化及凋亡基因可作为辅助指标。(3)具抗氧化功能芽孢杆菌菌株的筛选:将IPEC-1分为四组:G1(对照组)、G2(H202组)、G3(益生菌组)、G4(益生菌预处理+H202组)。用枯草芽孢杆菌SC02、解淀粉芽孢杆菌SC06、纳豆芽孢杆菌SC07、地衣芽孢杆菌SC08、多粘芽孢杆菌SC10、凝结芽孢杆菌SC12和解淀粉芽孢杆菌SC33以及H2O2依据组别分别处理细胞,测定凋亡及抗氧化基因,特别是HO-1基因的表达情况。结果发现:与H2O2组相比,SC06预处理可显著降低HO-1表达量41%,在所研究的七株益生菌中效果最显著。此外,SC06单独处理显著增加过氧化氢酶基因(catalase,CAT)和谷胱甘肽硫转移酶基因(glutathioneS-transferase,GST)的表达,而与H2O2组相比,SC06预处理不仅能下调超氧化物岐化酶(superoxidase-1,SOD-1)、谷脱甘肽过氧化物酶:(glutathioneperoxidase-2,GPX-2)和硫氧还原蛋白(thioredoxin-1,TRX-1)的基因表达,也可提高GST基因的转录水平。此外,SC06单独添加时可显著降低凋亡基因caspase3的表达,其预处理还能够显著上调抗凋亡基因的转录并下调促凋亡基因的表达。因此,SC06被确定为具有较好抗氧化调节功能的芽孢杆菌菌株,并在后续试验中探究其抗氧化作用及机理。试验二解淀粉芽孢杆菌SC06对仔猪生产性能和抗氧化功能的影响将90头体重相近的40日龄杜洛克×长白猪×大白猪(杜×长×大)仔猪随机平均分为三组:G1(基础日粮中含有150mg/Kg饲料金霉素)、G2(基础日粮中含有75mg/Kg饲料金霉素及1×108cfu/Kg饲料SC06)、G3(基础日粮中含有2×108cfu/Kg饲料SC06,且不含有任何抗生素),研究SC06对仔猪生长和抗氧化功能的影响及其作用机制。结果表明:SC06替代抗生素后能够显著提高仔猪的日增重和采食量,并能通过激活Nrf2-Keap1信号通路提高仔猪空肠的抗氧化功能。此外,当用SC06替代抗生素后,仔猪空肠自噬水平提高、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)酸化水平下降,而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达量增加。综上,SC06 替代饲料中抗生素可通过调控抗氧化信号通路和肠道自噬来提高仔猪的抗氧化功能并促进仔猪生长。试验三解淀粉芽孢杆菌SC06提高IPEC-1细胞抗氧化功能的机理根据试验一所述方法研究SC06对IPEC-1保护作用的分子机理。结果发现:SC06处理细胞3h可以通过激活Nrf2-Keap1信号通路提高细胞的抗氧化酶活性,同时SC06预处理还可降低NADPH氧化酶(NOX)活性和p47phox的表达来减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,从而提高线粒体膜电位(△ψm)。此外,SC06预处理还可缓解氧化应激导致的细胞凋亡和坏死。试验四解淀粉芽孢杆菌SC06对小鼠肥胖相关氧化应激及肝脏损伤影响本试验以高脂日粮饲喂的小鼠为实验材料,通过测定小鼠肝脏抗氧化通路、ROS含量、脂肪变性以及肠道菌群等指标以探明饲料中添加SC06减轻小鼠氧化应激及脂肪肝的可能机制。试验将60只6周龄的C57BL/6J雄性小鼠平均随机分成4个组,饲喂基础日粮(NC)适应一周后,再分别饲喂NC日粮,NC + SC06日粮、高脂日粮(HFD)、HFD + SC06日粮。饲喂周期为8周。(1)SC06对小鼠肥胖和胰岛素抵抗的影响:与对照组相比,NC + SC06对小鼠体重无显著影响,而HFD显著提高小鼠的平均体增重。此外,HFD + SC06可有效降低小鼠的体重。与HFD组日能量摄入量相比,NC组显著降低,而HFD+ SC06组略有降低。与对照组相比,HFD组小鼠肾周脂肪及皮下脂肪重量显著提高,而HFD+SC06组皮下脂肪重明显降低。脂肪组织HE切片发现,与NC及HFD组小鼠相比,SC06的处理有降低小鼠脂肪组织脂滴大小的趋势。此外,SC06还有助于缓解高脂引起的胰岛素抵抗。(2)SC06对小鼠肝脏损伤的影响:结合油红O染色及HE染色切片发现,HFD可诱导肝脏脂肪变性并提高血清中谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)活性,而HFD + SC06组肝脏中脂肪的积累减少,GPT活性略有降低。TUNEL和透射电镜切片结果显示,SC06会降低HFD诱导的肝脏细胞凋亡和线粒体损伤。(3)SC06对小鼠炎症因子和脂肪因子分泌的影响:HFD可显著提高血清肿瘤坏死因子 a(tumour necrosis factor,TNF-a)、白介素 1 β(interleukin,IL-1 β)、IL-6和瘦素(leptin)的含量,而添加SC06可明显降低TNF-α、IL-6和leptin的分泌。(4)SC06对小鼠肝脏抗氧化功能的影响:与NC组相比,NC + SC06组小鼠肝脏CAT活性显著提高,HFD组小鼠肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著提高;与HFD组相比,HFD + SC06组小鼠肝脏MDA含量降低。此外,NC + SC06和HFD显著增加Nrf2表达量和磷酸化水平,而HFD + SC06显著下调Nrf2的磷酸化。Keap1的表达在各组中没有明显变化。冰冻切片结果显示,HFD可明显提高肝脏中ROS水平,而添加SC06能降低ROS含量。(5)SC06对小鼠肠道菌群的影响:HFD与SC06均能够显著改变小鼠肠道菌群的结构。与HFD组相比,HFD + SC06组小鼠肠道拟杆菌门相对丰度提高、厚壁菌门及TM7菌门降低,在第8周时S24-7某些菌种的丰度恢复到正常水平。试验五解淀粉芽孢杆菌SC06对高脂诱导的氧化应激小鼠心理福利的影响高脂日粮诱导的肥胖及氧化应激能够影响大脑功能,造成动物心理和行为异常,从而影响动物的心理福利。根据前述研究结果,推测SC06同样也能够改善高脂引发的小鼠行为异常。将36只6周龄的C57BL/6J雄性小鼠平均分为3个组,饲喂NC适应1周后,再分别饲喂NC、HFD、HFD + SC06日粮,饲喂周期为6周。从第3周开始,HFD明显造成小鼠的肥胖,而用SC06处理5周后,小鼠体重明显下降。对能量摄入量进行分析,发现饲喂HFD能显著提高日能量摄入。此外,HFD显著提高小鼠肝脏及附睾脂肪重量,而SC06有效降低肝脏重及附睾脂肪重。高架十字迷官(elevated plus maze,EPM)和旷场实验(open field test,OFT)表明,HFD组中小鼠表现出明显焦虑行为,而SC06处理能有效缓解焦虑。对社交行为的分析也发现,HFD能够损害小鼠的正常社交行为,而添加SC06显著增强其社交能力。同时,与HFD组相比,HFD + SC06组海马体和大脑皮层中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达显著上调,N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NR)下调。此外,SC06还可通过激活大脑Nrf2-Keapl信号通路、降低ROS浓度及改善线粒体形态降低大脑氧化应激水平。对炎症水平的测定发现,HFD显著提高系统炎症,而SC06的添加可以降低促炎因子的表达并提高抗炎因子水平。同时,SC06还可促进空肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin的表达从而提高肠道屏障功能。综上,SC06的摄入能够通过调控BDNF和NR的表达、提高抗氧化功能、增强肠道屏障功能、降低机体炎症来改善肥胖相关氧化应激造成的行为异常