湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd)是原产于我国的抗性较强的苹果砧木之一,是研究木本植物抗逆性机制非常重要的植物材料。本文以‘湖北海棠’为试材,构建了水杨酸处理后的湖北海棠全长cDNA文库,从中分离了MhNPRl、MhTGA2转录因子以及病程相关蛋白基因(Mhchititl、MhGlu、MhPR1、和MhPR5)序列,对这些基因表达特性和功能进行了分析,建立了利用口蹄疫病毒2A序列构建植物三价融合表达载体的技术体系,构建了三价融合表达载体MhTNC (MhGGA2-2A-MhNPR1-2A-Mhchitl),并对其功能进行了初步分析,主要结果如下：1.以湖北海棠为材料,经水杨酸处理后,通过改良的CTAB法提取总RNA,纯化后构建全长cDNA文库。结果表明：提取的总RNA无降解,无污染。mRNA弥散带主要集中在500～2000 bp左右,没有rRNA残留。dscDNA弥散带主要分布于300-2000bp之间,PCR验证后片段大小分布于200-2000bp之间,说明合成dscDNA质量较好,成功地构建了全长cDNA文库。2.湖北海棠MhNPRl基因的全编码区cDNA序列为1761bp,命名为MhNPR1 GenBank序列登录号FJ5981431。基因组全编码区序列长为2259bp,GenBank序列登录号GU183100。序列比对结果表明,该基因编码区与拟南芥AtNPR1,水稻OsNPRl基因类似,含有3个内含子和4个外显子。MhNPRl基因组序列的长度和拟南芥相近,其内含子相对位置也同于拟南芥。该蛋白包括9个保守的半胱氨基酸残基、BTB和ANK_REP_REGION两个结构域。分离了1238bp的上游启动子序列,序列分析表明,该基因的5’UTR区含有一个601bp的内含子,该启动子区域含有1个水杨酸作用元件、2个乙烯响应元件、2个茉莉酸甲酯响应元件、3个赤霉素响应元件、2个热胁迫响应元件、1个厌氧响应元件,1个加强转录元件。另外,还包括一些光响应元件。3.利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)研究了植物激素SA、MeJA、ACC和生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫处理后的MhNPR1基因的表达情况。结果表明：MhNPRl在湖北海棠叶片中的表达量最大；SA在叶片、茎、根中均可以诱导该基因的表达,MeJA、ACC仅在根中诱导该基因的表达；苹果轮纹病病原菌在转录水平上未能诱导该基因的表达；苹果蚜虫在叶片和茎中可以诱导该基因的表达。4.构建了湖北海棠MhNPR1基因的植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将其转化模式植物烟草,通过PCR和RT_PCR对其抗性株系进行检测,MhNPR1基因已经成功地插入烟草基因组中并得到了表达。转基因烟草株系中NtPR1、NtPR3和NtPR5基因的表达量得到了上调,T1代植株在苗期表现出较强的抗灰霉病能力。转基因烟草株系中抗渗透胁迫NtSPS、NtSAM1、TOBLTP、ERD10A、ERD10B、ERD10C、ERD10D和抗氧化基因NtCA、NtSOD、NtRbohD的表达量得到了上调。转基因烟草株系T1植株在种子发芽、苗期都表现出较强的抗盐性,To代植株、T1代植株在种子发芽、苗期表现出较强的抗渗透胁迫能力。总之,湖北海棠MNPR1基因在植物的防御反应中具有多重抗性。5.通过RACE技术结合电子克隆的方法克隆了湖北海棠一个bZIP类转录因子,利用生物信息学的方法对其进行序列分析。实验结果表明,该基因全长1541bp,最大开放阅读框为999bp,编码333个氨基酸,5’UTR区有191bp,3’UTR区有351bp。氨基酸序列含有典型的bZIP结构域,亮氨酸结构域,在氨基酸的C端含有YX2RL[RQ]ALSS[LS]W结构,属于典型的bZIP-D结构。系统进化树分析表明：湖北海棠MhTGA2与菜豆TGA2.1、菜豆TGA2.2、葡萄TGA2、杨树TGA2.1亲缘关系最近,聚为一类,说明我们克隆的bZIP类转录因子属于TGA2类转录因子,命名为MhTGA2, Gen Bank上的登录号为FJ598138。亚细胞定位实验表明MhTGA2蛋白定位于细胞核中。MhTGA2在叶片中的表达量最大；SA、MeJA、ACC可以诱导MhTGA2基因的表达；苹果轮纹病病原菌未能诱导该基因的表达。转MhTGA2基因烟草中NtPRs (NtPR1、NtPR2、NtPR3)以及抗逆相关基因NtSOD、NtPPO、NtPAL、NtAPX的表达量得到了提高。6.克隆了湖北海棠第1类几丁质酶基因,命名为Mhchitl。亚细胞定位研究表明该基因位于细胞膜和细胞壁。植物激素SA.MeJA.ACC可以诱导湖北海棠叶片、茎、根中Mhchitl基因的表达。苹果轮纹病病原菌可以诱导Mhchitl基因的表达,3h后表达量增加,6h后表达量达到最大,随后表达量降低。在湖北海棠叶片、茎中,苹果蚜虫可以诱导该基因的表达。将该基因构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草。与非转基因烟草相比,转基因烟草中抗逆相关基因NtSOD.NtAPX.NtPPO,和NtPAL的表达量增加。转基因烟草株系抗灰霉病能力增加,抗PEG6000能力增强。说明Mhchot1基因不仅参与SA介导的抗病性,而且参与JA/ET介导的抗病性,具有多种抗逆功能。7.克隆了湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列和基因组DNA序列,该基因编码区含有一个内含子。该基因与桃、李和葡萄的核苷酸序列同源性为84、83、和77%,氨基酸序列同源性分别为84、74、和76%。通过基因组步移法克隆了该基因上游的启动子序列,启动子序列含有SA、MeJA和ET作用元件。利用荧光定量RT-PCR分析表明SA、MeJA和ACC均可以诱导湖北海棠叶片、茎、和根中的MhGlu基因的表达。在苹果轮纹病病原菌处理的96h内,湖北海棠MhGlu基因在24h时表达量开始上调,48h达到最大,随后降低。在湖北海棠叶片和茎中,苹果蚜虫可以诱导MhGlu基因的表达。总之,MhGlu基因是湖北海棠中抗生物胁迫的基因。8.分离了病程相关蛋白基因MhPR1、MhPR5的全编码区的cDNA和基因组DNA序列,MhPR1、MhPR5的最大开放阅读框分别为492bp、741 bp,分别编码162、246个氨基酸。MhPR5在基因编码区含有一个内含子,MhPR1没有内含子。这两个基因与苹果、梨的同源性较高,亲缘关系较近。通过与苹果基因组序列分析比较结果表明：MhPR1、MhPR5在苹果基因组中有多个拷贝,分别有4、3个拷贝。这两个基因在N端均含有一个信号肽,并且MhPR1、MhPR5分别含有6、10个保守的半胱氨基酸残基。荧光定量PCR分析结果表明MhPR1、MhPR5在湖北海棠各种组织中的表达存在差异。SA、MeJA、ACC在湖北海棠的叶、茎、和根中均可以诱导MhPR1和MhPR5基因的表达,分析表明MhPR1和MhPR5是湖北海棠SAR中的标记基因。9.以pMD19-T为中间载体,首先对其进行了改造,然后将MhTGA2、MhNPRl、和Mhchit1基因依次连接在中间载体上,命名为T2AN2AC,然后将其一并酶切,连接于植物表达载体上,成功地构建了植物三价融合表达载体,命名为MhTNC。通过农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草株系。通过PCR和RT-PCR实验表明,MhTGA2、MhNPR1、和Mhchit1三个基因已经成功地插入到烟草的基因组中,并且得到了转录。与野生型株系相比,转基因烟草株系表现出早花现象,矮化、节间数显著较少,节间显著增长。并且具有抗灰霉病和抗PEG6000的能力。