小鼠细胞中SRPK1对Drosha的调控及可能的作用机制研究

来源 :山东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zjbme2010
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mi RNA是一类长度约20~24 nt的非编码单链小分子RNA,是基因表达的重要调控因子,参与生物体内几乎任何一种已知的生理过程和包括癌症在内的病理过程。研究并理解mi RNA合成及调控的机制,对于我们找到疾病的致病机理,研发有效的药物和治疗方法具有重要的实践意义。Drosha是一个核定位的RNase III,主要参与水解pri-mi RNA为pre-mi RNA的过程,是mi RNA加工中重要的酶类之一。序列分析发现,Drosha的N端存在着一个富含精氨酸和丝氨酸的区域(RS-rich domain),与m RNA剪切中重要的调控蛋白SR蛋白中所含的RS domain十分相似。研究表明,SR蛋白RS domain内的磷酸化水平与其功能密切相关,只有正常磷酸化的SR蛋白才可以穿梭回到细胞核内行使功能。SR蛋白特异性激酶SRPKs是一类特殊的丝氨酸/苏氨酸激酶,该家族的两个成员SRPK1和SRPK2均可在细胞质内渐进性的磷酸化SR蛋白的RS domain,因而对于维持SR蛋白的功能至关重要。我们认为Drosha可能作为一种特殊的SR蛋白,被SR蛋白特异性激酶SRPK1磷酸化:首先,研究表明SRPK1可被Drosha免疫共沉淀,且是该免疫共沉淀物中唯一的激酶;其次,我们实验室前期的实验表明,SRPK1可与Drosha互作;第三,Phospho Site Plus数据库的质谱分析结果表明,Drosha的RS-rich domain中存在多个磷酸化位点。本文旨在解析Drosha是否为SRPK1的潜在底物,分析Drosha磷酸化如何调控mi RNA合成,并进一步探讨SRPK1介导的Drosha磷酸化水平的变化影响其功能的分子机制。首先,我们通过pull-down实验以及磷酸激酶实验验证了SRPK1可在体外与Drosha直接结合并将其磷酸化。随后进行的质谱分析确认了位于Drosha中的四个磷酸化位点:S201,S237,S300和S302,而据此设计的Drosha的去磷酸化四突变体(kinase-dead mutations,S to A)无法在体外被SRPK1磷酸化。这些结果证明了SRPK1可以作为Drosha的激酶,在体外直接磷酸化其RS-rich domain,并且S201,S237,S300和S302是SRPK1磷酸化Drosha的关键位点。其次,为解析SRPK1是否影响mi RNA的生物合成,我们进行了基因组水平上的mi RNA profiling。结果显示,在我们检测到的239个mi RNA中有36个mi RNA的表达量在SRPK1敲除后发生了显著的变化:23个下降的,13个上调的。随后进行的定量PCR验证了mi RNA profiling的可靠性。综合这些实验结果,我们证明了敲除SRPK1可以影响mi RNA的生物合成。随后,我们挑取了SRPK1敲除前后差异显著的mi RNA作为候选,利用Q-PCR分别验证它们的pri-mi RNA和pre-mi RNA的变化,确认了SRPK1对mi RNA合成的影响发生在pri-mi RNA水解为pre-mi RNA,即Drosha的作用过程中。最后,我们利用免疫荧光以及免疫共沉淀实验初步探讨了SRPK1影响mi RNA生物合成的可能机制。我们发现,当SRPK1 knock down或检测到的Drosha的磷酸化位点发生突变后,Drosha的亚细胞定位发生了变化,由细胞核中弥散到细胞质中。同时,细胞内Drosha与DGCR8的互作也受到了影响,表明二者的互作依赖于Drosha RS domain内的磷酸化,SRPK1可以通过调控Drosha的磷酸化水平来影响其与DGCR8的互作,进而影响两者在mi RNA生物合成中行使各自的功能。本论文结果证明了1,SRPK1可以作为Drosha的激酶在体外将其磷酸化,并通过蛋白质谱确认了Drosha中SRPK1的磷酸化位点,这些磷酸化位点与预期的一样,都位于RS-rich domain内;2,敲除SRPK1可以影响mi RNA合成中pri-mi RNA水解为pre-mi RNA,即Drosha发挥作用的过程;3,证明了SRPK1可以通过改变Drosha的磷酸化水平,调控其与DGCR8的互作,改变Drosha的亚细胞定位,使部分Drosha由细胞核弥散到细胞质中。这些结果充分证明了SRPK1通过调控Drosha的磷酸化进而影响了mi RNA的生物合成。SRPK1是m RNA剪切以及细胞信号转导中的重要激酶之一,找到其通过Drosha调控mi RNA合成的可能机制促进我们在基因表达调控方面的研究,对于我们找到mi RNA失调的致病机理有着重要的理论和临床应用价值。
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