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第一部分MEG3调节VSMC功能在螺旋动脉重铸中的作用目的通过研究MEG3在子痫前期胎盘和蜕膜中的表达,同时在基因水平靶向调控MEG3在人主动脉血管平滑肌细胞系HA-VSMC中的表达,探讨MEG3调节VSMC功能在螺旋动脉重铸中的作用。方法1.实验分组:子痫前期组和正常妊娠对照组:收集两组孕妇晚孕期胎盘和蜕膜组织,q RT-PCR检测两组组织中MEG3的表达;2.收集正常孕妇人工流产蜕膜组织,利用原位杂交定位MEG3在螺旋动脉肌层的表达,3.MEG3的调控:(1)上调MEG3:转染MEG3过表达质粒至VSMC(MEG3过表达组);(2)下调MEG3:转染MEG3干扰质粒至VSMC(MEG3抑制组);(3)分别转染相应的空白质粒(阴性对照组);(4)不做处理的VSMC(空白对照组);4.检测转染效率:q RT-PCR检测MEG3 m RNA表达;5.CCK-8法测定转染后各组细胞活性;6.流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡水平;7.Transwell模型检测转染后各组细胞的迁移能力;结果1.子痫前期组胎盘和蜕膜组织中MEG3的表达明显低于正常孕妇;原位杂交结果显示MEG3广泛表达于蜕膜间质和螺旋动脉肌层。2.与空白对照组相比,MEG3过表达组MEG3 m RNA表达显著升高;MEG3抑制组MEG3 m RNA表达水平降低,阴性对照组与空白对照组相比无显著性差异。3.与阴性对照组相比,MEG3过表达组细胞活性降低,凋亡相对数量增加,迁移能力增强。4.与阴性对照组相比,MEG3抑制组细胞活性增强,凋亡相对数量减少,迁移能力下降。结论MEG3可能通过调控VSMC凋亡和迁移,参与螺旋动脉重铸过程,与子痫前期发病机制相关。第二部分MEG3作为竞争性内源RNA调控mi R-21介导VSMC功能目的明确mi R-21对VSMC生物学功能的影响,并探索MEG3调控mi R-21机制。方法1.q RT-PCR检测子痫前期和正常孕妇晚孕期胎盘和蜕膜组织中mi R-21表达水平;2.mi R-21的调控:(1)上调mi R-21:转染mi R-21 mimic至VSMC;(2)下调mi R-21:转染mi R-21 inhibitor至VSMC;(3)分别转染相应的空白质粒(阴性对照组);(4)不做处理的VSMC(空白对照组);3.检测转染效率:q RT-PCR检测mi R-21表达;4.CCK-8法测定转染后各组细胞活性;5.流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡水平;6.Transwell模型检测转染后各组细胞的迁移能力;7.VSMC转染MEG3过表达质粒和干扰质粒,q RT-PCR检测mi R-21表达。结果1.子痫前期组胎盘和蜕膜组织中mi R-21的表达明显高于正常孕妇。2.与空白对照组相比,mi R-21过表达组mi R-21表达显著升高;mi R-21抑制组mi R-21表达水平降低,阴性对照组与空白对照组相比无显著性差异。3.与阴性对照组相比,mi R-21过表达组细胞活性增强,凋亡相对数量减少,迁移能力下降。4.与阴性对照组相比,mi R-21抑制组细胞活性降低,凋亡相对数量增加,迁移能力增强。5.上调VSMC MEG3表达,mi R-21表达降低,下调VSMC MEG3表达,mi R-21表达增加。结论MEG3通过调控mi R-21介导VSMC凋亡和迁移,可能是螺旋动脉重铸过程的重要机制。第三部分d NK细胞分泌TGF-β1调节MEG3对VSMC功能的影响目的明确d NK细胞分泌的TGF-β1对VSMC中MEG3表达的调控及生物学功能的影响。方法1.分离培养原代d NK细胞,流式细胞术检测细胞纯度;2.细胞分组:(1)空白对照组;(2)阴性对照组;(3)MEG3抑制组(VSMC转染MEG3抑制质粒);(4)TGF-β1组(外源性TGF-β1处理VSMC);(5)TGF-β1+MEG3抑制组(转染MEG3沉默质粒后加入TGF-β1);(6)d NK组(d NK细胞上清液处理VSMC);(7)d NK+TGF-β1受体抑制剂组(d NK细胞上清液加入TGF-β1受体抑制剂预处理的VSMC);3.q RT-PCR检测各组MEG3 m RNA表达;4.q RT-PCR和Western Blot检测各组细胞中MMP-2的表达;4.CCK-8法测定各组细胞活性;5.流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;6.Transwell模型检测各组细胞迁移。结果1.检测所提细胞纯度:表型为CD56+CD3-d NK细胞的纯度>92%。2.d NK细胞上清和外源性TGF-β1促进细胞凋亡和迁移能力,抑制细胞活性。当细胞TGF-β1信号被TGF-β1受体抑制剂阻断后,d NK上清对细胞的活性、凋亡和迁移无显著影响,与d NK组相比,细胞的活性增强,凋亡和迁移水平降低。3.d NK细胞上清和外源性TGF-β1促进细胞MEG3和MMP-2的表达,当细胞TGF-β1信号被TGF-β1受体抑制剂阻断后,与空白对照组相比,d NK+TGF-β1受体抑制剂组MEG3和MMP-2表达增加,与d NK组相比,d NK+TGF-β1受体抑制剂组MEG3和MMP-2表达降低。4.当沉默细胞中MEG3的表达后,与阴性对照组相比,TGF-β1+MEG3抑制组MEG3和MMP-2表达降低,但是无统计学意义,与TGF-β1组相比,MEG3和MMP-2表达降低。结论d NK细胞分泌的TGF-β1可以激活MEG3和MMP-2的表达,促进VSMC凋亡和迁移能力,可能是子宫螺旋动脉重铸的重要调控机制。第四部分PDC模型验证MEG3对螺旋动脉重铸的作用目的通过早孕胎盘蜕膜共培养模型体外观察MEG3在子宫螺旋动脉重铸过程中的作用。方法1.取正常人早孕绒毛及蜕膜组织,构建PDC模型,在PDC培养体系中加入MEG3干扰慢病毒,对照组加入空白慢病毒;2.q RT-PCR检测两组组织中MEG3 m RNA表达3.IHC染色检测共培养后的蜕膜组织结构和子宫螺旋动脉重铸情况;4.TUNEL检测组织细胞凋亡水平。结果1.MEG3抑制组MEG3 mRNA表达显著低于阴性对照组。2.IHC染色结果显示,MEG3抑制组EVT数目较少且侵润程度较表浅,血管平滑肌层尚未瓦解,迁移数目少,子宫螺旋动脉重铸处于更早期阶段。3.TUNEL结果显示,MEG3抑制组组织间质可见凋亡细胞,但螺旋动脉肌层排列整齐,细胞未见凋亡,阴性对照组凋亡细胞较多,可见凋亡的VSMC,肌层排列紊乱。结论子宫螺旋动脉重铸的EVT依赖阶段,MEG3可能通过调控EVT的功能间接介导VSMC崩解。