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中药在防治血栓性疾病中的临床疗效逐渐受到了重视,为抗血栓药物使用禁忌及高危血栓性疾病的防治提供了新途径。毛冬青为我国传统活血通脉中药,为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属（Ilex）植物毛冬青（Ilex pubescens Hook.Et.Arn.）干燥根,具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效,化学成分主要包括三萜类、环烯醚萜类、木脂素类、有机酸类等。药理研究表明毛冬青可治疗心脑血管和动脉血栓类疾病。本文针对毛冬青抗血栓的药效物质基础不清楚和作用机制不明确等问题,对毛冬青体内外化学物质组及体内过程进行了研究,并运用代谢组学方法对毛冬青提取物及其各极性部位抗血栓作用机制进行研究,阐释毛冬青多组分、多途径抗血栓的协同作用机制。1.毛冬青化学成分的定性、定量研究（1）基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）技术对毛冬青化学组分体内外的定性研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术快速、准确鉴定分析毛冬青中各类化学成分,在正负离子模式下对毛冬青药材进行化学轮廓分析。在采集的总离子流图中,木脂素类、酚酸类主要分布于0～10 min,而三萜成分主要集中在6～20 min。利用建立的EIC（extracted ion chromatograms）和MDF（mass defect filter）结合的方法,共鉴定出了毛冬青中74种化合物。其中,三萜类化合物45个,木脂素类化合物4个,环烯醚萜类化合物3个,黄酮类化合物2个,酚酸、氨基酸、脂肪酸等其他类化合物共20个。采用上述建立的分析方法对毛冬青入血成分进行鉴定,结果共鉴出45种入血化学成分,其中三萜成分29种,环烯醚萜类、木脂素类、脂肪酸等16种。（2）基于UPLC-Q/TOF-MS技术对毛冬青中9种三萜成分含量测定文献报道及入血成分检测结果提示三萜类成分是毛冬青中主要活性成分,因此,三萜类成分是其药材质量控制的关键指标。本研究首次建立了同时测定9种三萜成分（ilexoside O、ilexsaponin B3、pedunculoside、ilexsaponin B2、ilexsaponinA1、ilexsaponin B1、ilexgenin A、calenduloside E 和 ilexpubson A）的 UPLC-Q/TOF-MS 定量方法,并对12批次毛冬青药材、根皮及心材进行了分析。结果表明,ilexgenin A、ilexsaponin A1和ilexsaponin B3在各产地药材中的含量显著高于 ilexoside O、pedunculoside、ilexsaponin B2等其他成分,其中,ilexgenin A和ilexsaponin A1含量最高。这9种三萜在毛冬青根皮中的含量明显高于在毛冬青药材和心材中的含量。2.毛冬青三萜类成分体内代谢转化研究根据含量测定结果选取高含量化合物ilexgeninA（IA）和ilexsaponinA1（IA1）作为毛冬青三萜类成分苷和苷元的代表性成分,采用灌胃给药的方式,在不同时间点眼眶取血,利用UPLC-Q/TOF-MS法测定血浆中IA和IA!的含量,研究IA和IA!的药代动力学特性。本研究同时对IA和IA1不同时间点代谢产物及其代谢时效关系进行分析,为进一步研究毛冬青三萜类成分体内的代谢机制提供参考和依据。（1）毛冬青总皂苷（IPTS）及其单体皂苷（IA和IA1）药代动力学研究通过优化液相参数、碰撞能、去簇电压和特征离子等条件建立同时测定大鼠血浆中IA和IA1的UPLC-Q/TOF-MS法。采用负离子模式分析单体给药和IPTS给药后IA和IA1在大鼠血浆中的浓度,并利用DAS软件分析二者体内药代动力学差异。被测成分分别在0.38-1040 ng/mL（IA）和0.13-1060 ng/mL（IA1）范围内线性关系良好,方法专属性、基质效应、精密度、准确度和稳定性均符合生物样品分析要求。采用已建立方法比较单体形式给药时IA和IA1血浆中的药代动力学特征,以及复杂成分给药后IA和IA1血浆中的药代动力学特征。结果发现单体形式给药时IA和IA1在大鼠体内吸收较快,而由苷IA1转化得到的IA的达峰时间明显延长,Tmax在5.67～6.33 h。单体给药后IA和IA1的吸收程度显著高于IPTS组,表明单体形式给药相对于复杂成分给药更有利于单体成分吸收。（2）IA和IA1血浆中的代谢产物分析运用 Metabolite PilotTM 1.5 和 PeakView? 2.0 软件对 0、4、8、12、24 和 48 h 时间点血浆中IA和IA1代谢产物进行筛选和分析,研究代谢产物在血浆中的代谢时效关系。根据代谢物的保留时间和二级质谱信息,在大鼠血浆中共鉴定出IA代谢产物21个和IA1代谢产物32个,代谢途径包括水解、氧化、硫酸化、葡萄糖醛酸化、甲基化、脱甲基化等。0-8 h时间段血浆中检测出的代谢产物最多,8-24 h和24-48 h时间段血浆中检测出的代谢产物的数量相对减少。各个时间段代谢类型存在差异,8-24 h时间段检测到的代谢产物M13经推测是由原型经硫酸化反应而生成,而24-48 h时间段检测到的代谢产物M16和M19经推测是由原型经N-乙酰半胱氨酸和硫半胱氨酸反应而形成。3.毛冬青提取物对急性血瘀证大鼠模型的药效学和代谢组学研究采用皮下注射肾上腺素、冷水刺激的方法建立急性血瘀证大鼠模型,对毛冬青总提物抗血栓的药效进行评价,并利用非靶向的代谢组学发现其潜在病理机制,再针对关键环节,探讨毛冬青总提物（IP）、总皂苷（IPTS）及非皂苷部位（IPNT）抗血栓的药效和机制差异。本研究主要利用基于UPLC-Q/TOF-MS技术的代谢组学方法筛选内源性差异代谢物,构建相关靶向代谢通路,观察毛冬青提取物对病理模型相关代谢通路中靶点代谢物变化的影响,探讨毛冬青提取物体内多途径、多靶点的活血化瘀作用机制,为血栓相关性疾病的预防和治疗提供重要依据。（1）毛冬青提取物抗血栓的药效研究通过检测各组大鼠血液流变学、凝血功能和血管内皮功能相关生化指标,如血小板聚集率（PAR）、血浆黏度（WBV）、活化部分凝血活酶时间（APTT）,凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、血纤维蛋白原（FIB）、血栓烷素B2（TXB2）、6酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）、内皮缩血管肽（ET）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）等,考察毛冬青提取物对血瘀证大鼠凝血功能、血管内皮功能等调节作用。实验结果表明IP的抗血栓作用与其改善血管内皮的受损程度、抗凝血及抑制血小板聚集作用有关。此基础上,后期进一步考察了毛冬青不同组分（IP、IPTS及IPNT）对血液流变学、凝血功能和血管内皮功能相关药效指标的调节作用,发现IP的调节作用最为显著,其次为IPTS,而IPNT未显现出调节作用。（2）IP对血瘀证大鼠的血清代谢组学研究利用基于UPLC-Q/TOF-MS技术的血清代谢组学,整体描述血瘀证大鼠血清的内源性成分的代谢轮廓,并使用SIMCA软件对正常与模型组进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）,评价血瘀证模型和筛选差异代谢物。采用MetPA（Metabolomic Pathway Analysis）对血清中鉴定的差异代谢物进行通路分析,构建相关靶向代谢通路。结果共鉴定出了 18个差异标志物,其中11个是能够反映血瘀证大鼠与正常组、IP给药组大鼠之间差异有统计学意义的血清代谢产物。研究发现IP可通过调节大鼠体内的花生四烯酸代谢途径和甘油磷脂代谢途径对血瘀证起一定的预防作用。（3）IP、IPTS和IPNT对血瘀证大鼠的脂质代谢组学研究甘油磷脂代谢是IP体内发挥作用的主要潜在脂质通路,针对此关键环节,本研究利用CH2Cl2-CH3OH提取法对血清中的脂质进行富集,开展毛冬青不同组分IP、IPTS及IPNT对血瘀证大鼠的脂质代谢组学研究。结果发现除甘油磷脂代谢通路外,鞘脂代谢和甘油酯代谢同样是毛冬青干预血瘀证的重要脂质相关的靶向通路。通过比较毛冬青各组分对相关代谢途径涉及的差异标志物LPC（16:0）、LPC（18:2）、LPC（18:0）、LPC（18:1）和CE（20:4）的调节作用,发现IP的调节作用最为显著,其次为IPTS,而IPNT未显现出调节作用。通过以上研究,本文1)建立了适用毛冬青体内外化学成分定性的UPLC-Q/TOF-MS方法;2)阐明了毛冬青中代表性三萜吸收入血的药动特征和代谢规律;3)药效学和组学研究发现,毛冬青可通过调节花生四烯酸代谢和相关脂质代谢,并改善血管内皮受损和抑制血小板聚集的联合机制达到抗血栓的作用;4)初步阐明了三萜类成分为毛冬青中潜在体内药效物质基础,阐释了毛冬青多组分、多途径抗血栓的协同作用机制,为后期毛冬青相关研究提供基础研究资料。