哈密大枣、木纳格葡萄再生体系建立及遗传转化研究

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yaozi303
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冷/冻害是影响植物生长的重要非生物胁迫伤害。新疆是我国红枣和葡萄的主产区之一,而冻害在新疆时有发生,已成为制约新疆林果业发展的重要因素之一。利用转基因手段提高植物抗寒能力,培育转基因抗寒果树,可为解决新疆果树冻害提供新途径。本研究建立了哈密大枣和木纳格葡萄不定芽再生体系,并通过根癌农杆菌介导CBF基因转化,获得哈密大枣和木纳格葡萄转基因植株。主要试验结果如下:(1)以哈密大枣叶片为外植体,探讨了基本培养基、不同激素、暗培养时间等因素对不定芽再生的影响,建立了再生体系。结果表明,外植体经过10mg/L Vc浸泡15min之后,接种于以NN69为基本培养基并添加1mg/LTDZ+0.2mg/L IBA+1mg/LAgNO3的培养基中,暗培养2周后转入光照培养30d,再将外植体转入MS+1mg/L6-BA+0.2mg/L IBA不定芽分化培养基中使不定芽进一步分化。不定芽生长至3cm以上时,转至0.4mg/L IBA的1/2MS培养基上进行诱导生根。(2)以哈密大枣叶片为根癌农杆菌介导的受体材料,建立了适合哈密大枣叶片遗传转化的体系。结果表明,叶片浸染农杆菌前预培养2d,侵染菌液浓度为OD600为0.5,侵染时间为20min,侵染后在共培养培养基NN69+TDZ1mg/L+IBA0.2mg/L中暗培养3d,转入筛选培养基NN69+TDZ1mg/L+IBA0.2mg/L+AgNO31mg/L+Kan20mg/L+Cef300mg/L中先暗培养9d后光照培养30d,之后转接到选择分化培养基MS+6-BA1mg/L+IBA0.2mg/L+Kan20mg/L+Cef300mg/L继续光照培养,光照周期为14h光照/10h黑暗。将CBF基因转入哈密大枣中,通过PCR检测初步确定有7株转基因阳性植株。(3)以木纳格葡萄品种为材料,研究外植体类型、不同培养基、不同激素种类及浓度、暗培养时间对木纳格葡萄不定芽诱导的影响。结果表明,叶片、叶柄、茎段三种外植体诱导不定芽,只有叶片、叶柄能够诱导出不定芽。以叶柄为外植体在NN69+TDZ1mg/L+IBA0.2mg/L培养基上诱导率最好,为16.3%;以叶片为外植体在NN69+TDZ4mg/L+IBA0.2mg/L培养基上诱导率最好。不定芽转接到MS+6-BA1mg/L+IBA0.2mg/L培养基上伸长培养效果更好。(4)以木纳格葡萄叶片和叶柄为受体,通过农杆菌介导转化CBF基因。结果表明,叶片、叶柄Kan临界浓度为5mg/L,Cef最适浓度为300mg/L。在葡萄遗传转化后,采用延迟筛选,起始浓度为2.5mg/L逐步增加到5mg/L,可减少对再生的抑制。采用此体系对‘木纳格’葡萄进行转化,共获得12株抗性植株,PCR检测结果表明,5株PCR呈阳性,初步证实CBF基因整合到木纳格葡萄基因组。
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