酒精滥用引发的多器官、多系统功能障碍和严重的精神及社会问题，已引起世界各国的普遍关注，成为全球范围内重要公共卫生问题。酒精作为兼具亲脂和亲水双重特性的高渗透性小分子和强烈的氧化应激源，在机体代谢过程中产生大量的自由基与活性氧，导致脂质过氧化、蛋白质氧化、DNA损伤和加合物的形成，是酒精引起肝脏及多器官损伤的重要机制。然而，对于酒精性氧化损伤的防治，孤立地依赖于传统的抗氧化剂，临床上并没有取得预期效果，而内源性抗氧化系统的激活，可能才是防治酒精性氧化损伤的关键。在机体各种内源性抗氧化蛋白中，Ⅰ型血红素氧化酶(HO-1)因其良好的可诱导性、强大的抗氧化活性在沉寂数十年后受到了空前的关注，HO-1的诱导对于多种疾病和应激性损伤具有良好的保护效应，甚至被认为是防御氧化应激的首选靶基因。然而，“经典”的HO-1诱导剂如血红素(heme)、钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)等具有潜在的过氧化毒性，基因转染也存在安全和效率等方面的问题，使HO-1的诱导仅限于实验室研究而难以得到实际应用。近年来人们兴奋地发现，一些天然的黄酮类或多酚类抗氧化剂，如姜黄素、槲皮素、银杏黄酮等可诱导HO-1表达，并由此展示出协同而增强的抗氧化效应和更为广泛的药理活性。有鉴如此，本研究以具有优良抗氧化和护肝效应的银杏黄酮作为干预物，采用酶学与生化分析、RT-PCR、流式细胞术、Western Blot、病理及超微病理等研究手段，通过动物试验，系统探讨急、慢性酒精暴露及银杏黄酮干预对血清和肝、心、肾、睾丸抗氧化系统及血清脂质水平的影响，在此基础上，以肝损伤为重点，进一步研究长期酒精摄入与不同剂量银杏黄酮干预对肝脏结构与功能、线粒体与微粒体抗氧化系统以及HO-1 mRNA、蛋白表达与酶活性(HO-1及CYP 2E1)水平的影响，主要内容如下：第一部分银杏黄酮对小鼠急性酒精暴露后抗氧化系统的保护作用尽管对酒精性损伤的氧化应激机制己开展了大量研究，但基于生物体的复杂性，乙醇摄入对机体抗氧化系统的具体影响至今报道不一。因此，本部分采用酶学与生化分析手段，探讨小鼠急性酒精暴露及银杏黄酮干预后血清与肝脏抗氧化系统的变化，以探寻相应的时间-效应关系。实验结果显示：小鼠急性酒精暴露(4.8 g／kg)后1～15h内，血清与肝脏GSH水平与抗氧化酶活性呈“U”形变化，而MDA水平呈明显的倒“U”形变化，且恢复较慢。其中血清GSH水平与SOD活性在2h降至最低，GSH-Px活性4h最低，降低幅度分别为23.5％、20.3％和20.2％，MDA水平4h最高(升幅32.4％)；肝脏GSH水平与GSH-Px、SOD活性在4h降至最低，降低幅度分别为29.3％、18.4％和23.6％，而MDA水平在6h升至最高(升幅27.5％)。预先经银杏黄酮(96 mg／kg)干预，可增强机体在急性乙醇暴露初期的代偿反应，减轻小鼠酒精摄入所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂质过氧化，促使受损的抗氧化系统尽快恢复。以上结果表明，小鼠急性酒精暴露后2～6h，尤其是4h，可明显影响到血清与肝脏的抗氧化水平，而银杏黄酮干预可在一定程度上缓解这种影响而表现出良好的保护效应。第二部分大鼠酒精摄入后血清抗氧化系统与脂质水平的动态变化及银杏黄酮的保护效应流行病学调查资料显示，饮酒量不同，心血管疾病与糖尿病的发生风险也各异，提示不同水平的酒精摄入可能对机体健康有不同的影响。因此，本部分以大鼠为研究对象，探讨不同剂量的酒精持续摄入不同时间后，血清抗氧化水平与脂质水平的动态变化，在此基础上，研究不同剂量的黄酮干预对不利变化的影响。实验结果显示：大鼠摄入低剂量的酒精(0.8g／kg)30、60、90天后，血清GSH、MDA、TG与TC水平无明显变化，但SOD、CAT与GSH-Px活性则不断升高，HDL-C在90天明显升高；大鼠摄入中剂量的酒精(1.6g／kg)30、60、90天后，血清GSH水平逐渐下降，SOD与GSH-Px活性先升高后下降，CAT活性与MDA、TG、TC水平则持续升高，HDL-C轻微升高后逐渐回落；大鼠摄入高剂量的酒精(2.4g／kg) 30、60、90天后，血清GSH与HDL-C水平及SOD、GSH-Px活性不断下降，CAT活性轻微升高后明显下降，而MDA、TG、TC水平不断上升。对高剂量酒精摄入大鼠进行银杏黄酮(48及96mg／kg)干预，尤其高剂量(96mg／kg)干预，在不同时间均可部分抑制或降低酒精所致的抗氧化酶失活程度、GSH与HDL-C水平的下降及TG、TC与MDA水平的上升幅度，缓解高剂量酒精摄入对血清脂质水平及抗氧化系统的影响。以上结果表明，低剂量酒精摄入，可在一定程度上激活机体的抗氧化系统和升高HDL-C水平，从而产生相应的保护效应；中剂量的酒精摄入，尤其是长时间摄入后，血清脂质水平及过氧化程度不断升高，抗氧化水平总体呈先轻微升高后明显下降的趋势，氧化应激不断累积和加重；高剂量酒精摄入则进一步加重机体的氧化应激和脂质代谢紊乱程度。对高剂量酒精摄入大鼠进行银杏黄酮干预，尤其是高剂量银杏黄酮干预，可以缓解酒精的影响，显示出明显的调节血脂和拮抗酒精性氧化应激的作用。第三部分长期酒精摄入对大鼠组织抗氧化系统的影响及银杏黄酮的干预作用长期嗜酒不仅严重影响到肝功能，还可诱发心肌受损、肾功能不全、睾丸生精异常等多器官的病变和损伤。乙醇的高度弥散性及在代谢过程中产生过量的自由基与活性氧，继而引起多组织的氧化损伤，是酒精相关性疾病的重要发病机制。因此，本部分在观察长期高剂量的酒精摄入对肝、心、肾、睾丸抗氧化系统影响的基础上，进一步探讨银杏黄酮干预对酒精诱导的多组织氧化损伤的保护作用。实验结果显示：大鼠摄入高剂量酒精(2.4g／kg)90天后，除肾SOD及心CAT活性无明显变化外，肝、心、肾、睾丸GSH水平、抗氧化酶活性及总抗氧化能力明显下降，而MDA与ROS水平明显升高。经不同剂量的银杏黄酮干预(48及96mg／kg)，尤其是高剂量(96mg／kg)干预，可明显减轻或部分抑制因酒精染毒所致的GSH消耗、抗氧化酶失活及总抗氧化能力下降，降低ROS的产生水平和脂质过氧化程度，从而在一定程度上缓解了酒精对肝、心、肾、睾丸抗氧化系统的影响。以上结果表明，长期高剂量的酒精摄入可导致肝、心、肾、睾丸多器官的氧化-抗氧化失衡，而银杏黄酮干预，尤其是高剂量银杏黄酮干预，可以减轻或抑制酒精对多器官抗氧化系统的影响，对多组织酒精性氧化应激具有良好的保护作用。第四部分银杏黄酮防御酒精性肝损伤相关机制的研究肝脏是酒精吸收后代谢的主要场所，也是酒精中毒的主要靶器官。本部分采用酶学与生化分析手段，并借助于RT-PCR、流式细胞术、Western Blot及超微病理等方法，进一步探讨高剂量酒精摄入后，大鼠肝脏结构与助能、肝线粒体与微粒体氧化-抗氧化系统、CYP 2E1活性及肝HO-1表达与酶活性的变化，在此基础上，研究不同剂量银杏黄酮的干预效果及相关机制。实验结果显示：长期的酒精摄入(2.4g／kg，90天)导致肝细胞严重脂变性、浊肿和水变性，肝功能异常，线粒体、微粒体出现明显的肿胀、变形与退化等病理性改变，氧化-抗氧化失衡，CYP 2E1活性升高近4倍，而HO-1 mRNA、蛋白表达及酶活性水平分别下降55.0％、49.3％和45.5％；银杏黄酮(48及96mg／kg)干预，尤其高剂量(96mg／kg)干预，可明显减轻乙醇所致的病理性改变和线粒体及微粒体的氧化损伤，抑制CYP 2E1的活化，并在mRNA、蛋白与酶活性水平对HO-1具有明显的诱导作用，而对其它抗氧化蛋白无明显激活作用。以上结果表明，长期的酒精摄入削弱了肝细胞线粒体与微粒体抗氧化水平，抑制了HO-1的表达与活性；银杏黄酮可能通过对HO-1的诱导而展示出协同和增强的抗氧化效应，从而更有效清除乙醇代谢过程中形成的大量ROS，保护机体的抗氧化系统，减轻乙醇所致的细胞和细胞器结构改变与功能损伤。综上所述，低剂量的酒精摄入，可能通过抗氧化系统的代偿性活化和HDL-C水平的升高而发挥协同的保护作用，但过量(尤其是长期过量)的酒精摄入，可导致严重的脂质代谢紊乱和多组织的氧化损伤。而银杏黄酮干预可以明显减轻酒精对机体脂质代谢和抗氧化系统的不利影响，降低肝脏等多组织的氧化应激程度，银杏黄酮对HO-1的诱导可能介导了其拮抗酒精性氧化应激的作用。当然，HO-1的介导作用有待在细胞水平利用HO-1特异性的抑制剂与诱导剂加以进一步证实。此外，银杏黄酮对HO-1诱导的信号通路，以及HO-1介导的保护效应究竟是对底物的及时清除，还是某种代谢产物的作用，亦或是综合作用的结果还有待进一步深入研究。创新点：1)一般认为适量饮酒对机体的健康效应可能与HDL-C有关，本研究发现抗氧化系统代偿性活化可能也参与了这种保护作用。2)长期过量的酒精摄入使机体逐步失代偿而导致脂代谢紊乱和多组织氧化-抗氧化失衡。除传统的抗氧化酶与GSH外，本研究首次发现，HO-1表达与活性的下降也可能与这种失代偿状态有关。3)本研究深入到线粒体与微粒体水平，并利用多种分子生物学手段系统探讨了银杏黄酮对HO-1的诱导防御酒精性肝损伤的作用，首次揭示了HO-1介导银杏黄酮拮抗酒精性氧化应激的机制。