动物实验与临床研究提示，心肌缺血再灌注损伤是常见的临床现象，心肌缺血后在一定时间内恢复血液供应，可导致缺血心肌发生更严重的损伤，这种由再灌注诱发的一系列有害反应，即为心肌缺血再灌注损伤，表现为再灌注性心律失常、再灌注性心肌顿抑等，普遍存在于急性心肌梗死及其溶栓治疗、PTCA、CABG、心脏移植等疾病状态和治疗中，对患者的预后和心功能恢复具有重要的决定作用。大量的基础和临床试验表明，心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，尚未完全阐明其机制。已有很多学说，目前认为，钙超载、氧自由基的爆发产生是主要发病环节。此外，心肌纤维能量代谢障碍和细胞凋亡等均可能参与缺血再灌注损伤的发病过程。 血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]是由天门冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、脯氨酸组成的七肽生物活性物质。它是在体内由血管紧张素I(AngⅠ)和AngⅡ经内肽酶作用转化而成。近年来研究证实，肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活参与了心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程，心肌中血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)水平的升高加重了心肌缺血与再灌注损伤，减少Ang Ⅱ的生成或拮抗其作用对心肌有保护作用。Ang-(1-7)是一种与前列腺素、缓激肽、一氧化氮作用有关的，具有扩张血管、降低血压、调节水钠平衡以及抑制血管平滑肌细胞增殖等拮抗AngⅡ生理作用的生物活性物质。前期实验利用离体大鼠心肌缺血再灌注模型探讨Ang-(1-7)对心肌缺血再灌注损伤的影响并探讨其可能机制。本课题将在乳鼠心肌细胞水平进行相关的实验。这种方法既能排除在体实验研究中存在的血流动力学、激素、神经反射等其他因素的影响，亦能排除离体实验研究中血管内皮因素的影响，能恰当反映Ang-(1-7)对心肌细胞本身缺血再灌注的影响。这将为防治心肌缺血再灌注损伤提供新的理论和方法，为Ang-(1-7)进一步研究提供实验依据。 研究目的:本课题通过建立乳鼠心肌细胞缺血再灌注模型，观察Ang-(1-7)对心肌细胞缺血再灌注损伤的影响，并对其发挥作用的可能机制进行初步探讨。 方法： 1、原代心肌细胞培养参照文献方法分离心肌细胞，通过差速贴壁分离法纯化心肌细胞，使纯度达到90％以上。首次换液为分离后24小时，以后每48小时换液。分离后的前72小时培养基内需要添加BrdU。培养第5天的心肌细胞作实验用。 2、缺血再灌注模型的建立以高纯氮气持续通气30分钟饱和无糖D-Hanks液作为缺血液；以纯氧持续通气30分钟饱和含糖D-Hanks液作为再灌注液。模拟缺血时以缺血液分别灌注各组心肌细胞，再将培养板放入密闭容器，并以10L/分钟流量的混和气体(95％N2和5％CO2)充入密闭容器，持续20分钟，同时关闭进气口和出气口。到达预计缺血时间后打开密闭容器，取出培养板，并将细胞培养液换为换再灌注液继续作用相应时间。 3、细胞存活率测定用CCK-8试剂在酶联免疫检测仪选择450nm波长测定吸光度(0.D．)，参比波长650nm。另设定空白对照为不加细胞只加培养液，空白孔调零。实验各组均为6个复孔，每组重复3次。细胞存活率(％)：实验组0.D．值/对照组0.D．值×100％。 4、细胞凋亡检测Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下(激发波长350nm，发射波长460nm)以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡情况。典型者可见染色质高度凝聚、边缘化，进而细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 5、实验步骤以及分组 5.1确定缺血再灌注时间点分别预设系列缺血时间和再灌注时间，观察不同时间细胞损伤的变化情况，寻求最佳实验时间点。 5.2 Ang-(1-7)对正常心肌细胞的影响培养第5天的心肌细胞换无血清培养基24小时，然后分别加入1O-5、10-6、10-7、10-8、10-9mmol/L Ang-(1-7)培养24小时。观察Ang-(1-7)是否能引起正常心肌细胞的增殖。 5.3 Ang-(1-7)对I/R心肌细胞的影响将同步化的心肌细胞随机分为对照组、10-5mmol/L、10-6mmol/L、10-7mmol/L、10-8mmol//L等不同浓度Ang-(1-7)组以及I/R组进行观察，评价不同浓度Ang-(1-7)在I/R时对心肌细胞的影响。 5.4 Ang-(1-7)对心肌细胞保护机制的探讨初步探讨Ang-(1-7)在缺血再灌注中发挥保护效应的机制，具体分组如下：对照组、Ang-(1-7)组、Ang-(1-7)+Tel组、Ang-(1-7)+AngⅡ组、Tel组、AngⅡ组以及I/R组。 6、统计学处理定量资料以均数±标准差表示，采用统计软件SPSS11.0行方差齐性检验。方差齐用单因素方差分析，方差不齐用秩和检验。P<0.05有统计学意义，P<0.01有显著统计学意义。 结果： 1、心肌细胞的形态学鉴定培养4～24小时后，在倒置显微镜下可观察到心肌细胞开始贴壁生长。培养2～3天，心肌细胞形成不规则星形细胞，并开始伸出伪足。培养第5天，心肌细胞的伪足基本交织成网，形成细胞单层，搏动呈同步化，频率约为90次/分。 2、缺血再灌注模型的时间点随着缺血时间的延长，心肌细胞存活率在不断下降。缺血1～4小时心肌细胞活力降低程度较为平缓，缺血时间在4～6小时之间心肌细胞活力下降最为剧烈，缺血时间大于6小时之后，心肌细胞活力下降速度再次再次变缓。其中，缺血5小时损伤组与其他各组比较的差异均有统计学意义。与对照组相比，再灌注2、4和6小时心肌细胞存活率的下降都有统计学差异。然而，再灌注组两两之间的差异并没有达到统计学差异。 3、正常情况下Ang-(1-7)对心肌细胞的影响与对照组相比，1O-5mmol/L Ang-(1-7)作用24小时后该组的心肌细胞增殖有显著统计学差异(P<0.001)；而其他浓度组心肌细胞与对照组比较并无统计学差异(P值依次为0.190、0.140和0.205)。 4、I/R时Ang-(1-7)对心肌细胞的影响与对照组相比，所有损伤组心肌细胞存活率下降都有显著统计学差异，而且P值均为<0.001。与I/R组相比，系列浓度Ang-(1-7)药物干预组的细胞存活率有显著改善。 5、探讨作用机制的实验结果显示损伤组细胞活力较对照组有显著下降。与I/R组相比，加入Ang-(1-7)的各组心肌细胞存活率有所改善；而未加入Ang-(1-7)的各组的心肌细胞存活率未见改善。其中，Ang-(1-7)组、Ang-(1-7)+Tel组以及Ang-(1-7)+AngⅡ组的心肌细胞存活率组间并无统计学差异。 结论： 本课题特点是在细胞水平观察Ang-(1-7)对缺血再灌注时乳鼠心肌细胞的影响，并且初步探讨其效应的可能作用机制。通过本项研究，取得以下结论： 1、缺血5小时，再灌注2小时建立的心肌缺血再灌注模型适合开展药物干预实验。 2、Ang-(1-7)能减少心肌细胞在缺血再灌注中导致的损伤。 3、Ang-(1-7)对心肌细胞的保护作用与AT2-R无关。