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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种多发生在老年、以认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病。脑内糖代谢紊乱是AD的一个重要特征之一。AD患者脑细胞葡萄糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成。动物实验研究也提示脑细胞葡萄糖代谢异常可能是AD病理生理发生的关键因素,能量代谢下降影响脑功能状态与线粒体功能,从而导致线粒体活性氧分子产生增加。硫胺素作为三羧酸循环(Kreb cycle)中限速酶一一丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase complex,PDHC)、α-酮戊二酸脱氢酶(a-ketoglutarate dehydrogenase complex,KGDHC)以及磷酸戊糖通路(pentose phosphate pathway,PPP)非氧化分支限速酶——转酮醇酶(transketolase,TK)的辅酶,在脑内糖代谢中起着关键的作用。硫胺素缺乏可致三羧酸循环和PPP的功能紊乱,从而导致脑内葡萄糖和能量代谢异常。流行病学调查发现老年人群、特别是AD病人中普遍存在亚临床硫胺素缺乏表现。AD患者血清硫胺素及其磷酸酯类衍生物水平与正常对照者相比明显下降。AD病人中血清TK、KGDHC和PDHC酶活性下降了50%或更多。同时,TD可导致选择性神经元死亡、炎症反应、神经胶质细胞异常活化等病理生理反应,与AD等年龄相关的神经变性疾病的特征性表现相类似。有研究表明TD可引起APP/PS1转基因小鼠脑内β-分泌酶活性及氧化应激增高从而加剧脑内β-amyloid (Aβ)沉积。此外,TD患者脑脊液磷酸化Tau蛋白水平升高。因此,我们认为硫胺素缺乏或代谢异常诱发的KGDHC和PDHC活性下降、线粒体糖代谢和能量代谢障碍可能是AD发病的重要危险因素,可能直接参与AD特征性病理改变如Tau蛋白异常磷酸化和Ap沉积等。同时研究者们发现老年人群中亚临床硫胺素缺乏与消化道吸收能力下降或合并其他疾病并无相关性,那么是什么导致老年人普遍的硫胺素缺乏呢?研究者常采用饮食硫胺素剥夺和硫胺素拮抗物注射两者结合以制作硫胺素缺乏模型,目前多数AD与TD有关的研究成果均来自对此种方法制作的模型的研究。然而,流行病学研究证明,存在亚临床硫胺素缺乏的老年人群和AD患者并不存在饮食硫胺素缺乏的情况,那是否可以假设其硫胺素缺乏的状态是由某种硫胺素拮抗物质的存在所造成的呢?带着这个疑问,我们对小鼠分别进行饮食硫胺素剥夺或硫胺素拮抗物腹腔注射,以比较其对APP/PS1转基因小鼠和正常野生小鼠学习记忆能力和AD病理改变的影响,并进一步对可能的致病机制进行了相关研究。第一部分硫胺素缺乏和吡啶硫胺影响APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及AD相关病理改变的实验研究目的：研究吡啶硫胺及饮食硫胺素剥夺对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及脑内Ap沉积、Tau蛋白异常磷酸化等病理改变的影响。方法：20周龄雄性APP/PS1转基因小鼠,均随机分为空白对照组(正常饮食+生理盐水／d腹腔注射,简称空白组),吡啶硫胺低剂量组(正常饮食+250μg/kg/d吡啶硫胺腹腔注射,简称PT250组),吡啶硫胺高剂量组(正常饮食+500μg/kg/d吡啶硫胺腹腔注射,简称PT500组),饮食硫胺素剥夺组(饮食硫胺素剥夺+生理盐水／d腹腔注射,简称TD组)。各组小鼠每日腹腔注射一次,连续注射4周,后进行Morris水迷宫训练,水迷宫检测后经水合氯醛麻醉,生理盐水、多聚甲醛依次灌注后取脑,免疫组化染色观察脑内Ap沉积、Tau蛋白磷酸化情况。结果：第五天撤台实验中,在第Ⅳ象限游泳时间百分比指标上,APP/PS1转基因小鼠空白组为25.00±3.40%,PT250组为28.29±3.44%,PT500组为23.38±3.54%,TD组为20.30±4.97%,从数值上可见PT500组及TD组均有下降趋势,但行统计分析时并无明显统计学上差异。APP/PS1转基因小鼠脑内均有Ap沉积,以每张切片上Ap斑块沉积数量进行比较,空白组数为45.50±3.84,PT250组为77.25±6.00,PT500组为73.00±9.97,TD组为131.50±12.23,结果显示吡啶硫胺处理组及饮食硫胺素剥夺组斑块数均较空白对照组有明显增加,统计分析P<0.001。在200倍镜下计数皮层p-Tau阳性的细胞个数,以每mm2所含阳性细胞数进行比较,空白组为156.62±12.18,PT250组为204.30±25.27,PT500组为272.88±44.60,TD组为268.28±24.29,可见PT500组及饮食硫胺素剥夺组小鼠脑内p-Tau阳性的细胞个数较空白组明显增多(与空白组比较得PT500组P<0.05；TD组P<0.01)。结论：吡啶硫胺及饮食硫胺素剥夺对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的降低作用无统计学意义,但能明显加重AD相关病理变化。第二部分硫胺素缺乏和吡啶硫胺影响野生小鼠学习记忆能力及增加AD相关病理改变的实验研究目的：观察吡啶硫胺和饮食硫胺素剥夺对正常野生小鼠学习记忆能力及脑内AD沉积、Tau蛋白异常磷酸化等病理改变的影响方法：20周龄雄性APP/PS1转基因小鼠同窝对照野生小鼠,随机分为空白对照组(正常饮食+生理盐水／d腹腔注射,简称空白组),吡啶硫胺低剂量组(正常饮食+250μg／kg/d吡啶硫胺腹腔注射,简称PT250组),吡啶硫胺高剂量组(正常饮食+500μg／kg/d吡啶硫胺腹腔注射,简称PT500组),饮食硫胺素剥夺组(饮食硫胺素剥夺+生理盐水／d腹腔注射,简称TD组)。各组小鼠每日腹腔注射一次,连续注射4周,后进行Morris水迷宫训练,水迷宫检测后小鼠经水合氯醛麻醉,生理盐水、多聚甲醛依次灌注后取脑。脑组织行石蜡包埋,切片后进行免疫组化染色观察脑内Ap沉积、Tau蛋白磷酸化情况。正常野生小鼠脑内无明显斑块沉积,为对其各组Ap含量进行比较,我们分取小鼠皮层脑组织行Aβ1-42ELISA定量检测。结果：第五天撤台实验中,在第1V象限游泳时间百分比指标上,野生小鼠空白组为38.28±4.52%,PT250组为24.38±2.98%,PT500组为21.36±3.62%,TD组为15.41±2.14%,可见野生小鼠吡啶硫胺处理组及TD组均有明显下降趋势(与空白组相比示PT250,PT500组P<0.05：TD组P<0.01)。ELISA定量检测结果显示空白组为406.86±18.17pg／mg,PT250组为493.02±25.99pg/mg,PT500组为582.58±22.91pg／mg,TD组为602.38±20.09pg／mg,可见吡啶硫胺处理组及TD组小鼠脑内Ap含量均较空白组明显增多(统计示PT250组P<0.05；PT500组及TD组P<0.001)。在200倍镜下计数皮层p-Tau阳性的细胞个数,以mm2阳性细胞数进行比较,空白组为131.22±8.98,PT250组为155.58±9.59,PT500组为178.27±9.83,TD组为171.69±8.52,吡啶硫胺处理组及TD组均较空白对照组小鼠明显增多(与空白组相比示PT500组P<0.05；TD组P<0.01)。结论：吡啶硫胺及硫胺素缺乏均能明显降低正常野生小鼠学习记忆能力,同时加剧AD相关病理改变。第三部分硫胺素缺乏和吡啶硫胺对野生小鼠脑内糖合酶-3活性的影响目的：研究吡啶硫胺及饮食硫胺素剥夺对脑内GSK-3活性的影响,促进对硫胺素缺乏加重AD病理改变的相关致病机制的理解。方法：20周龄雄性APP/PS1转基因小鼠同窝对照野生小鼠,随机分为空白对照组(正常饮食十生理盐水／d腹腔注射,简称空白组),吡啶硫胺低剂量组(正常饮食+250μg／kg/d毗啶硫胺腹腔注射,简称PT250组),吡啶硫胺高剂量组(正常饮食+500μg／kg/d吡啶硫胺腹腔注射,简称PT500组),饮食硫胺素剥夺组(饮食硫胺素剥夺+生理盐水／d腹腔注射,简称TD组)。各组小鼠每日腹腔注射一次,连续注射4周。小鼠经水合氯醛麻醉、生理盐水灌注后迅速取脑并冻存于-80度冰箱中待用。脑组织从-80度中取出后,每只小鼠组织一分为二,分别用于western blot及酶活检测。Western blot进行p-GSK-3α,GSK-3α,p-GSK-3β,GSK-3β检测,比较正常野生小鼠各组间p-GSK-3α/GSK-3α,p-GSK-3β/GSK-3p比值变化。依试剂盒方法行GSK-3,GSK-3α,GSK-3β酶活性检测,比较各组间酶活性变化。结果：Western blot结果示空白组p-GSK-3a/GSK-3a比值为1.445±0.114,PT250组为1.454±0.071,PT500组为1.225±0.245,TD组为0.879±0.120。空白对照组p-GSK-3β/GSK-3β比值为0.6154±0.089,PT250组为0.573±0.121,PT500组为0.348±0.099,TD组为0.298±0.060。结果示正常野生小鼠吡啶硫胺处理组及饮食硫胺素剥夺组p-GSK-3α/GSK-3α比值及p-GSK-3β/GSK-3β比值均较空白组下降。酶活结果同样示吡啶硫胺处理组及饮食硫胺素剥夺组GSK-3酶活性均明显升高。结论：吡啶硫胺及饮食硫胺素剥夺均能使小鼠脑内p-GSK-3α/GSK-3α, p-GSK-3β／GSK-3β下降,使GSK-3酶活性升高,表明GSK-3可能参与硫胺素缺乏加重AD相关致病机制。