肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)作为骨骼肌生长的负调控因子,自发现以来,对其研究主要集中在基因敲除或过表达对肌肉的影响及在体外对细胞增殖和分化的影响等方面。近来的研究表明,MSTN可以通过下调骨骼肌蛋白的合成来抑制肌肉的肥大,进而影响肌肉生长。然而,其调节蛋白合成的信号途径还不是很清楚。骨骼肌是营养程序化的敏感组织,妊娠和／或哺乳期间母体营养不良或蛋白限饲,均可影响肌纤维的可塑性,从而影响其表现型。我们前期的研究发现,母体日粮蛋白水平可以改变子代骨骼肌功能基因MyHC的表达,并且这种影响有阶段差异,即短期的效应和长期的效应。然而母体日粮蛋白水平是否影响骨骼肌的蛋白合成及MSTN的表达尚不清楚,其影响是否具有阶段差异也不清楚,对于造成这种差异的分子机理更是知之甚少。本研究以梅山猪为动物模型,研究母猪妊娠期和哺乳期饲喂不同蛋白水平的日粮对子代骨骼肌蛋白合成及MSTN转录调控的影响及其机制。1母体日粮蛋白水平对子代血清中胰岛素和氨基酸水平及肌纤维横截面积的影响本实验选用14头初产的小梅山母猪,体重在36.1±1.8kg范围内,随机分为标准蛋白组和低蛋白组。在妊娠期和哺乳期饲喂等能量但饲料粗蛋白含量不同的饲料。在妊娠和哺乳期间,标准蛋白组分别饲喂粗蛋白含量为12%和14%的日粮,而低蛋白组则分别饲喂粗蛋白含量6%和7%的日粮。在分娩后24小时内,每个处理组每窝调整为7-8只小猪进行实验,在仔猪出生后35天断奶,断奶后,两个处理组的仔猪均给以正常蛋白水平的日粮饲喂,直至8月龄出栏。分别在断奶(35天)和育肥(8月龄)进行样品采集。用BCA法测定断奶仔猪和育肥猪背最长肌的蛋白浓度,用经典HE染色法染色,测定断奶和育肥阶段背最长肌肌纤维横截面积,用放射免疫分析法检测血清中的胰岛素水平,用氨基酸自动分析仪检测血清中的游离氨基酸水平。结果显示：仔猪到35天断奶,低蛋白组的体重、肌肉重及肌肉蛋白含量均显著低于标准蛋白组(P<0.05),低蛋白组断奶阶段背最长肌肌纤维的横截面积显著低于标准蛋白组(P<0.05),低蛋白组断奶阶段血清中胰岛素水平下降,血清中游离氨基酸水平尤其是支链氨基酸水平极显著降低(P<0.01)；而到育肥阶段,无论是体重、肌肉重及肌肉蛋白含量还是血清中胰岛素水平、游离氨基酸水平,两组之间均无明显差异；而与标准蛋白日粮组相比,低蛋白组背最长肌肌纤维的横截面积有上升的趋势(P=0.057),说明母体日粮蛋白水平可能通过影响子代断奶阶段血清中胰岛素及氨基酸的水平来影响背最长肌的蛋白合成。2母体日粮蛋白水平对子代背最长肌胰岛素和氨基酸-下游信号-通路及MSTN下游信号-通路的影响通过以上研究发现,母体日粮蛋白水平影响到血清中胰岛素及氨基酸的水平,是否影响其下游信号,从而影响骨骼肌的蛋白合成?是否其它因素也参与影响骨骼肌的蛋白合成?我们运用Western blotting方法检测了胰岛素的下游信号胰岛素受体(Insulin receptor,IR)和Akt的蛋白表达,同时检测了氨基酸下游蛋白质合成关键因子——p70S6K和eIF4E的表达。用Real-time PCR检测了肌肉发育相关基因(MSTN、 MyoD、MEF2和Myogenin)及氨基酸下游相关基因的表达,结果发现,母体日粮蛋白水平并没有影响胰岛素的下游信号,但母体低蛋白日粮显著下调了子代断奶阶段氨基酸下游蛋白合成关键因子p70S6K和eIF4E的磷酸化水平(P<0.05),并显著下调了氨基酸下游信号eIF2a的表达(P<0.05)；同时我们还发现母体低蛋白日粮显著降低了断奶仔猪氨基酸信号下游关键基因ATF4、LAT1和CHOP的表达(P<0.05),然而对肌肉发育相关的基因除MSTN外,并无显著影响。MSTN是氨基酸敏感基因,并且对骨骼肌蛋白质的合成起重要的调节作用。母体低蛋白日粮,显著降低了子代断奶阶段背最长肌MSTN的mRNA水平(P<0.05),但显著上调了育肥阶段MSTN的mRNA水平(P<0.05)。于是,我们检测了MSTN的受体ACVR2B和ALK5的表达,并检测了其下游信号smad2/3、p38-MAPK、ERK和JNK及其磷酸化形式的表达。结果发现,低蛋白组断奶阶段背最长肌ACVR2B的：mRNA水平显著升高(P<0.05),ALK5的nRNA水平有升高的趋势(P=0.073);smad2和p38-MAPK的磷酸化水平显著升高；而育肥猪两组之间没有显著差异,提示母体日粮蛋白水平可能通过氨基酸和MSTN信号通路影响子代断奶阶段骨骼肌蛋白的合成。3母猪日粮蛋白水-平影响子代背最长肌MSTN转录调节的分子机理由以上的研究,我们发现母体日粮蛋白水平对MSTN的mRNA水平在断奶和育肥阶段的影响截然相反,为探索母体程序化作用的机制,我们运用Western blotting方法检测背最长肌MSTN转录因子(FOXO1、MyoD、CREB和C/EBPβ在核内的表达。结果显示,到断奶阶段,低蛋白组C/EBPβ (LAP*)在核中的表达显著降低(P<0.05)；提示C/EBPβ可能参与MSTN的转录调控。而到育肥期C/EBPβ的蛋白表达,两组之间均无显著差异。为了探讨C/EBPβ是否参与MSTN的转录调控,采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法检测了C/EBPβ在MSTN启动子区的结合情况。结果发现,断奶阶段,低蛋白组C/EBPβ与MSTN启动子区的3个预测的结合位点的结合情况显著降低(P<0.05),而育肥阶段,低蛋白组C/EBPβ与3个预测的结合位点中的2个的结合情况显著升高(P<0.05)；这与MSTN的mRNA水平变化一致,提示C/EBPβ参与MSTN的转录调控。为探索表遗传是否参与MSTN的转录调控,运用ChIP方法检测了MSTN启动子区的组蛋白修饰情况,结果显示,育肥阶段,低蛋白组组蛋白的乙酰化水平显著升高(P<0.05),组蛋白H3第9位赖氨酸的一甲基化(H3K9me1)水平显著降低(P<0.05),而组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化(H3K27me3)水平显著升高(P<0.05),而断奶阶段两组之间组蛋白的修饰并无显著差异,提示组蛋白的修饰可能参与了育肥阶段MSTN的转录调控。Real-time PCR险测了以MSTN为靶的miRNA的表达,发现育肥阶段低蛋白组miR-500和miR-136的表达显著降低(P<0.05),miR-27a的表达有下降的趋势(P=0.057),而断奶阶段两组之间miRNA的表达并无显著变化,提示miRNA可能参与了育肥阶段MSTN的转录调控。以上结果提示：妊娠和哺乳期间母体日粮蛋白水平影响MSTN的转录调节,并且这一影响呈阶段特异性。断奶阶段MSTN的转录调节可能由C/EBPβ介导,而育肥阶段MSTN的转录不仅由C/EBPβ调节,而且表遗传因素——组蛋白修饰和miRNA也参与其调节。