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第一部分创伤性脑损伤后Fos-like抗原1的表达及其意义背景与目的:神经元凋亡是创伤性脑损伤后神经化学信号级联诱导继发性脑损伤的重要过程,调控神经元的凋亡是减轻颅脑创伤(Traumatic brain injuries,TBI)后机体运动、感觉和自主神经功能障碍重要途径之一。Fos-like抗原1(Fra-1)是转录因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族中的一员,转录因子复合物AP-1是在生物过程中调节基因转录的关键因素。作为AP-1家族成员之一,多个途径汇聚在一起调控Fra-1的表达。Fra-1为整合多路径信号转导通路提供了一个动态平台,将内在或外部激活路径连接在一起,通过刺激或参与这些过程中基因的表达,在细胞的运动、侵袭以及调控细胞凋亡和增殖中起着至关重要的作用。本部分研究的目的旨在明确中枢神经系统中Fra-1表达的定位,研究其在颅脑损伤模型中表达的变化,探讨Fra-1对神经元凋亡的影响及可能存在的调控机制。方法:1.在整体水平构建CNS损伤模型,设定手术组、假手术组及对照组;2.分别在颅脑损伤后不同时间节点,运用Western blot测定Fra-1蛋白表达,分析其在此过程中的变化;3.免疫组化法及免疫荧光法确定Fra-1在中枢神经系统中细胞的定位;4.分别在颅脑损伤后不同时间节点,采用Western blot测定蛋白表达,分析活化的Caspase-3在此过程中的变化;5.运用免疫荧光双标法研究Fra-1与活化的Caspase-3神经元关系,探讨Fra-1与神经元凋亡存在的潜在联系。结果:1.蛋白电泳分析发现Fra-1在损伤侧大脑皮层的表达显著增加,随时间推移逐步升高,三天到达顶峰后逐步下降,14天后基本降至正常。假手术组及对照组Fra-1表达变化不明显;2.免疫组化染色分析发现损伤三天后,大鼠皮层中的Fra-1阳性细胞显著增加;3.免疫荧光双标提示Fra-1主要是与神经元(Neure)在大脑皮层共同表达,在星形胶质细胞中的表达比较少。TBI 3d后大鼠皮层Fra-1阳性神经元数量明显增加;4.脑损伤后大鼠脑皮层活化的Caspase-3的表达呈时间依赖性升高,并与Fra-1表达增加平行相关;5.免疫荧光双标记法显示,Fra-1与活化的Caspase-3共定位。结论:Fra-1主要定位于皮层神经元。TBI后大鼠皮层Fra-1表达呈时间依赖性上调,在损伤第3天达到峰值,后逐渐下降,28d后基本降至正常。TBI后,大鼠脑皮层活化的Caspase-3及P53的表达呈时间依赖性升高,并与Fra-1表达平行相关。Fra-1与活化的Caspase-3在皮层神经元共定位。提示Fra-1与神经元凋亡存在潜在联系。第二部分Fos-like抗原1对创伤性脑损伤后皮层神经元凋亡的影响及调控背景和目的:在第一部分的研究中发现Fra-1主要表达于大脑皮层的神经元细胞中。颅脑损伤后神经元细胞中Fra-1的表达明显升高,与凋亡相关蛋白活化的Caspase-3表达呈正相关。由此表明Fra-1与神经元的凋亡密切相关。P53基因是一种抑癌基因,P53的激活可调控多种信号传导通路,引起包括神经元在内的多种细胞凋亡。P53依赖性凋亡的激活可导致线粒体凋亡性的改变,最显著的是细胞色素C的释放和Caspase级联反应的激活,引起细胞死亡的发生。Fra-1作为一种原癌基因编码的转录因子与多条信号传导通路有关,颅脑损伤后Fra-1表达的升高通过何种机制激活P53传导通路,从而调控神经元的凋亡是我们进一步研究目标。本部分旨在细胞水平上构建颅脑损伤模型,进一步研究Fos-like抗原1与凋亡相关因素的关系,探讨其对创伤性脑损伤后皮层神经元凋亡可能存在的调控机制。方法:1.细胞水平上构建过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型,分别在颅脑损伤后不同时间节点,运用Western blot分别测定Fra-1、Caspase-3及P53的蛋白表达,分析其在此过程中表达的变化;2.运用免疫荧光双标法研究Fra-1与活化的Caspase-3的定位关系,探讨Fra-1与神经元凋亡存在的潜在联系;3.构建靶向Fra-1的si RNA干扰Fra-1表达,Western blot分析活化的Caspase-3及P53表达的变化;4.流式细胞仪及Tunel法等分析这些干预对细胞凋亡的影响;5.细胞计数试剂盒评估干预前后细胞活力的变化。结果:1.蛋白电泳分析发现Fra-1在P12细胞损伤模型中的表达显著增加,随时间推移逐步升高,3h到达顶峰后逐步下降,12h后基本降至正常。2.细胞损伤后活化的Caspase-3及P53的表达呈时间依赖性升高,并与Fra-1表达的增加呈正相关;3.免疫荧光双标提示Fra-1与活化的Caspase-3表达增加,且二者存在共定位关系;4.构建4个独立的si RNA靶向Fra-1,发现转染Fra-1 si RNA 5′-CTCTGACCTACCCTCAGTA-3′对PC12细胞的Fra-1表达有明显的干扰作用,可使Fra-1表达明显下调。Western blot提示Fra-1表达下调后,活化的Caspase-3和P53的表达同步下降。5.Annexin-V/7-AAD凋亡分析和Tunel法显示Fra-1表达的下调进一步降低细胞凋亡。6.细胞生存能力测量提示当PC12细胞暴露于不同浓度的H2O2时,以剂量依赖性的方式降低了细胞的存活率。然而,Fra-1表达的下调显著增加细胞的生存能力。结论:当PC12细胞暴露于不同浓度的H2O2,时,以剂量依赖性的方式降低细胞存活率。20%,浓度的H2O2作为刺激最适剂量,且在刺激后3h达到细胞凋亡的最佳效果。si RNA 5′-CTCTGACCTACCCTCAGTA-3′可明显干扰Fra-1表达。Fra-1在颅脑损伤后随时间推移表达逐步上调,P53及凋亡相关蛋白活化的Caspase-3表达的变化与之一致,在刺激3h达到峰值,后逐渐下降;Fra-1与活化的Caspase-3存在共定位关系。si RNA干扰Fra-1表达,显著降低活化的Caspase-3和P53的表达,抑制细胞的凋亡,增强细胞的活性。