神经递质的释放是神经系统行使正常功能和传递信息的基础,而神经递质的释放主要是通过囊泡胞吐过程来完成,这一过程涉及到了多种蛋白质、脂质分子等物质的参与,是一个非常复杂的过程。目前国际上囊泡胞吐和胞吞过程分子机制与调节正成为科学家们的研究热点,这对于揭示神经信号传递、学习与记忆、细胞分泌活动、细胞的生长、膜上结构和功能蛋白质的嵌入等重要生命过程有着极其重要的理论意义,也具有广阔的应用前景。SNARE (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor)蛋白是介导囊泡与细胞膜或其它细胞器融合的主要蛋白分子。SNARE蛋白核心复合体是膜融合的分子基础,为膜融合提供能量。Snapin蛋白最初是在神经细胞中作为与SNARE复合物中的SNAP-25结合蛋白被发现的,在神经元细胞中表达量丰富,其分子量约为15kDa。TrkA受体是一种酪氨酸激酶受体,同其它酪氨酸激酶受体一样,其受体膜内区的酪氨酸被磷酸化后,可以被其它信号分子识别,为信号的传导提供有关蛋白的募集位点。肝细胞生长因子的受体Met也是一种酪氨酸激酶的受体,它的酪氨酸激酶区同TrkA相比具有37%的同源性,有研究表明Snapin与Met之间有相互作用,所以我们推测Snapin蛋白与TrkA之间也应该有相互作用的可能,在本实验前期的实验工作中,已经通过酵母双杂交的方法初步验证了TrkA的膜内区(TrkAICD)与Snapin蛋白之间存在相互作用,本论文通过其它的分子生物学手段对Snapin蛋白与TrkA的相互作用进行了深入的研究。1、通过免疫共沉淀的方法,验证了Snapin和TrkA之间的相互作用。2, FRET(荧光能量转移)实验中,构建了pEYFP-N1-Snapin和pECFP-N1-TrkAICD两个真核表达载体,将这两个载体共转染至HEK293T细胞。采用光漂白的方法研究Snapin与TrkA之间的能量转移效率,结果表明Snapin和TrkA之间有明显的能量转移现象存在,成为Snapin和TrkA之间相互作用的佐证。3、构建了Snapin的N端和C端结构域至pGEX-6p-1的原核表达载体,采用GST-pull down实验技术手段,确定了Snapin的C端结构域是与TrkA作用所必需的。上述结果给继续深入开展研究Snapin与TrkA之间相互作用后的Snapin是否被磷酸化、有关信号转导的分子机制以及该相互作用是否影响胞吞、胞吐过程,进而调节神经递质的释放提供了有益的线索和奠定了一定的实验基础。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor6、TRAF6)是TNF受体相关因子家族成员之一,同时也是参与了蛋白的蛋白酶体降解途径的一种泛素连接酶,为多种生理过程的信号调节分子,与基因转录、细胞的增殖与凋亡有关。先天性和获得性免疫、骨代谢、淋巴结发育、乳腺发育甚至皮肤和中枢神经系统的发育无不与TRAF6密不可分。RanBPM(Ran binding protein in microtubule organizing center)开始是作为Ran的结合蛋白而发现的,并参与微管的成核现象而命名,是一种广泛表达而又高度保守的蛋白,可能与膜受体Trk和p75NTR的下游信号分子有关,我们前期的工作以及文献报道表明TrkA与RanBPM,而p75NTR与TRAF6在信号通路上相关联。在信号通路中,往往许多通路相互交叉而形成网络影响细胞的新陈代谢、生长分化。而信息学分析表明RanBPM上存在TRAF6的结合位点。因此基于上述考虑,我们认为有必要验证RanBPM和TRAF6可能确实存在的相互的作用,并且有其特定的功能、且影响着特定的信号传导通路。在本实验室的前期工作中,通过酵母双杂交体系、过表达免疫共沉淀和内原性免疫共沉淀的方法证明了RanBPM与TRAF6之间的相互作用,并且确定了RanBPM的SPRY区域是与TRAF6相互作用的区域,通过荧光素酶报告实验证明了RanBPM可以降低TRAF6引起的NF-κB通路的信号的传导。本论文的这一部分重点实验工作主要是承接以上的实验结果,开展对TRAF6与RanBPM之间相互作用机制的深入研究。1、根据TRAF6的结构域分析结果,构建了5个TRAF6不同结构域的pCMV-HA真核表达载体,利用免疫共沉淀的方法,确定了TRAF6的C端结构域是其与RanBPM作用所必需的区域。2、设计了三组实验,研究了过表达的RanBPM对内源TRAF6自身泛素化、过表达的RanBPM对过表达的TRAF6自身泛素化的影响以及RanBPM的表达量对TRAF6自身泛素化的影响程度,得出的结论一致,即RanBPM抑制了TRAF6自身泛素化。3、研究了RanBPM对NF-κB信号通路的抑制因子IκBα的影响,随着RanBPM表达量的增加Iκ3α的量也随之增加,进而说明了RanBPM对NF-κB信号通路的抑制作用,这与前期的实验结果相吻合。4、采用免疫荧光的方法,研究了RanBPM与TRAF6相作用对NF-κB的一个亚基p65的入核影响,结果是RanBPM抑制了TRAF6所引起的p65的入核现象,又一证据说明了RanBPM与TRAF6相作用抑制了NF-κB信号通路。5、流式细胞实验结果揭示了RanBPM可以抑制TRAF6所引起的细胞凋亡,并且随着RanBPM表达量的增加,对细胞凋亡的抑制作用也会增强。上述研究结果丰富了神经信号转导机制的研究的内容,同时也为研究信号通路所引起的细胞凋亡和分化的机制提供了理论及实验依据。