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目的:1.探讨麦芽酚铝对PC12细胞TNFR1、RIP1及RIP3的影响。2.通过分别干扰TNFR1、RIP1及RIP3,进一步探讨TNFR1、RIP1及RIP3在麦芽酚铝致PC12细胞程序性坏死中的调控作用。方法:1.培养PC12细胞,用Z-VAD-FMK和Nec-1分别对细胞进行干预,并用麦芽酚铝染毒。分别设置正常对照组、DMSO溶剂对照组、200μM Al(mal)3组、Z-VAD-FMK(20μM)组、Z-VAD-FMK+Al(mal)3组、Nec-1(60μM)组和Nec-1+Al(mal)3组,继续培养24h后测定各项指标:AO-EB染色观察细胞形态,CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率和坏死率,q RT-PCR法检测TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表达水平,Western blot法检测TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表达量。2.采用siRNA干扰TNFR1,Z-VAD-FMK和Nec-1处理细胞,麦芽酚铝染毒。分别设置正常对照组、转染阴性对照组、200μM Al(mal)3组、TNFR1 siRNA组、TNFR1siRNA+Al(mal)3组、TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK组、TNFR1siRNA+Z-VAD-FMK+Al(mal)3组、TNFR1 siRNA+Nec-1组和TNFR1siRNA+Nec-1+Al(mal)3组。继续培养24h后测定各项指标:CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率和坏死率,q RT-PCR法检测TNFR1、RIP1及RIP3 mRNA表达水平,Western blot法检测TNFR1、RIP1及RIP3蛋白表达量。3.干扰RIP1方法、分组及检测指标同2。4.干扰RIP3方法、分组及检测指标同2。结果:1.麦芽酚铝对PC12细胞的影响:(1)AO-EB染色观察细胞凋亡和坏死情况的变化:未经麦芽酚铝处理的各组细胞状态良好,染色质基本呈均匀绿染;Al(mal)3组凋亡细胞和坏死细胞明显增多;Z-VAD-FMK+Al(mal)3组凋亡细胞减少,坏死细胞增多;Nec-1+Al(mal)3组坏死细胞减少,凋亡细胞增多。(2)各组间细胞活力差异有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,各未染铝组间细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),各染铝组的细胞活力均下降(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,抑制剂处理并染铝组细胞活力明显升高(P<0.05)。(3)各组间细胞凋亡率和坏死率差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,染铝后各组细胞凋亡率均增加(P<0.05),Al(mal)3组和Z-VAD-FMK+Al(mal)3组细胞坏死率均增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3组细胞凋亡率降低(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3组细胞坏死率明显降低(P<0.05)。(4)各组间TNFR1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,各染铝组TNFR1 mRNA和蛋白表达增加(P<0.05),Nec-1组TNFR1蛋白表达量略有下降(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,抑制剂处理并染铝组TNFR1蛋白表达均下降(P<0.05)。与抑制剂处理组相比,相应抑制剂处理并染铝组TNFR1 mRNA和蛋白表达量明显增加(P<0.05)。(5)各组间RIP1 mRNA和蛋白表达差异有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,Nec-1处理后RIP1蛋白表达量明显下降(P<0.05),未经Nec-1处理的各染铝组的RIP1 mRNA和蛋白表达量明显增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3组RIP1 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3组RIP1 mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。与抑制剂组相比,相应抑制剂处理并染铝组RIP1 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05)。(6)各组间RIP3 mRNA和蛋白表达差异有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,Nec-1组RIP3 mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05),各染铝组RIP3蛋白表达量增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3组RIP3 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3组RIP3 mRNA和蛋白表达量略有下降(P<0.05)。与抑制剂处理组相比,相应抑制剂并染铝组RIP3 mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05)。2.TNFR1 siRNA干扰对麦芽酚铝染毒PC12细胞的影响:(1)各组间细胞活力差异有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,染铝后各组细胞活力均明显下降(P<0.05);与Al(mal)3组相比,凋亡、程序性坏死抑制剂处理后细胞活力增加(P<0.05)。与TNFR1siRNA组比较,干扰并染铝的各组细胞活力明显下降(P<0.05)。(2)各组间细胞凋亡率和坏死率差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,干扰后各组中,除TNFR1 siRNA+Z-VAD-FMK组外的其余各组细胞凋亡率均增加(P<0.05),除Nec-1+Al(mal)3外各染铝组细胞坏死率增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,干扰后各染铝组细胞凋亡率增加、坏死率下降(P<0.05)。与TNFR1 siRNA组相比,抑制剂处理后各组细胞坏死率均下降(P<0.05)。与TNFR1 siRNA+Al(mal)3组相比,Z-VAD-FMK+Al(mal)3组细胞凋亡率下降,坏死率增加(P<0.05),Nec-1+Al(mal)3组细胞凋亡率明显增加,坏死率下降(P<0.05)。(3)各组间TNFR1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,TNFR1 siRNA干扰后各组TNFR1 mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.05),TNFR1基因沉默效率达70%以上。与TNFR1 siRNA组相比,干扰后各染铝组TNFR1 mRNA和蛋白表达量均增加。(4)各组间RIP1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,干扰后各未染铝组及Nec-1+Al(mal)3组RIP1 mRNA和蛋白表达量均下降。与TNFR1 siRNA组相比,干扰后各未染铝组RIP1 mRNA和蛋白表达下降,各染铝组则表达增加(P<0.05)。与TNFR1 siRNA+Al(mal)3组相比,干扰后Nec-1+Al(mal)3组RIP1 mRNA和蛋白表达下降。(5)各组间RIP3 mRNA和蛋白表达差异有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,干扰后各组RIP3 mRNA和蛋白表达均降低;与TNFR1 siRNA组相比,干扰后各染铝组RIP3 mRNA表达水平明显上升(P<0.05),TNFR1 siRNA+Al(mal)3组RIP3蛋白表达增加(P<0.05)。3.RIP1 siRNA干扰对麦芽酚铝染毒PC12细胞的影响:(1)各组间细胞活力差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,Al(mal)3处理后各组的细胞活力均明显下降(P<0.05);与Al(mal)3组相比,RIP1 siRNA干扰后染铝组细胞活力有升高趋势,经抑制剂处理并染铝的PC12细胞活力明显升高(P<0.05)。(2)各组间细胞凋亡率和坏死率差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,染铝后各组细胞凋亡率均增加(P<0.05),除RIP1 siRNA+Nec-1+Al(mal)3组外各染铝组细胞坏死率增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,干扰后各染铝组细胞凋亡率和坏死率均下降。与RIP1siRNA组比,干扰后各染铝组细胞凋亡率均增加(P<0.05),RIP1 siRNA+Al(mal)3组细胞坏死率升高(P<0.05)。与RIP1 siRNA+Al(mal)3组相比,抑制剂处理并染铝组细胞凋亡率和坏死率均下降(P<0.05)。(3)各组间TNFR1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,各未染铝组TNFR1 mRNA表达无明显变化(P>0.05),各染铝组TNFR1 mRNA表达基本一致,均明显增高(P<0.05);RIP1siRNA干扰后TNFR1蛋白表达下降,其中Nec-1组下降明显(P<0.05)。(4)各组间RIP1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,干扰后各组RIP1 mRNA和蛋白表达量均明显下降(P<0.05),RIP1基因沉默效率达85%以上。(5)各组间RIP3 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,干扰后各组RIP3 mRNA和蛋白表达量均下降(P<0.05)。与RIP1 siRNA组相比,RIP1siRNA+Nec-1组RIP3 mRNA和蛋白表达量明显下降(P<0.05),干扰后各染铝组RIP3 mRNA和蛋白表达量均增加(P<0.05)。4.RIP3 siRNA干扰对麦芽酚铝染毒PC12细胞的影响:(1)各组间细胞活力差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,经Al(mal)3处理后各组的细胞活力均明显下降(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,干扰后各染铝组细胞活力升高(P<0.05)。与RIP3 siRNA组比较,干扰后各染铝组细胞活力下降(P<0.05)。与抑制剂处理组相比,相应抑制剂并染铝组细胞活力下降(P<0.05)。(2)各组间细胞凋亡率和坏死率差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,各染铝组细胞凋亡率和坏死率均显著增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,干扰后各染铝组细胞凋亡率均上升、坏死率下降(P<0.05)。与RIP3 siRNA组相比,Z-VAD-FMK组细胞凋亡率下降(P<0.05),Nec-1组细胞坏死率下降(P<0.05),干扰后各染铝组细胞凋亡率和坏死率增加(P<0.05)。与RIP3 siRNA+Al(mal)3组相比,抑制剂处理并染铝组细胞凋亡率无明显变化,坏死率下降。(3)各组间TNFR1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比,干扰后未染铝的各组间TNFR1蛋白表达量无明显变化,干扰并经Al(mal)3处理的各组TNFR1蛋白表达量增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,干扰后各染铝组TNFR1蛋白表达量均下降。(4)各组间RIP1 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.001)。与正常对照组相比,干扰后未染铝的各组和Nec-1+Al(mal)3组RIP1蛋白表达下降,余各染铝组RIP1蛋白表达明显增加(P<0.05)。与Al(mal)3组相比,经抑制剂和铝处理后RIP1 mRNA和蛋白表达量下降,其中Nec-1+Al(mal)3组差异有统计学意义(P<0.05)。(5)各组间RIP3 mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,RIP3 siRNA干扰后各组RIP3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05),RIP3基因沉默效率达99%以上。与RIP3 siRNA组相比,各染铝组RIP3 mRNA和蛋白表达均增加,但干扰后各组蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.麦芽酚铝可以诱导PC12细胞发生凋亡和程序性坏死。2.麦芽酚铝能够通过TNFR1-RIP1/RIP3信号通路诱导PC12细胞发生程序性坏死。