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研究背景/目的:骨肉瘤是全世界最常见的骨原发恶性肿瘤,因其高度恶性和侵袭性,一度排行青少年癌症死亡原因的第二位。近20到30年来骨肉瘤的治疗进展十分缓慢,5年或更长期的总生存率并没有得到显著的改善。自噬(Autopahgy)是指通过溶酶体介导的细胞吞噬自身蛋白或细胞器并降解的一种高度保守的细胞现象。很多研究发现,自噬参与了恶性肿瘤的发生和转移,但其作用十分复杂并富有争议。探索自噬在骨肉瘤不同阶段的作用和调控因素,有利于发现骨肉瘤治疗的新分子靶点。TSSC3(Tumor-suppressing STF cDNA 3)是郭乔楠教授课题组在人成骨细胞恶性转化过程中利用基因芯片技术发现的出现明显差异表达的印迹基因之一。前期研究已经证实其在骨肉瘤中起到抑癌基因作用,但其分子机制有待进一步阐明。TSSC3的同源基因PHLDA1,被证实可以调控细胞自噬,提示TSSC3可能对自噬也有一定的调控作用。除此之外,有研究发现自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR的活化可能受到Src的影响,而前期研究发现TSSC3可以抑制骨肉瘤Src的分子活性。由此我们推测骨肉瘤细胞中TSSC3可能通过Src与自噬发生联系。因此,本文目的在于探讨TSSC3调控自噬对骨肉瘤发生和转移的潜在作用和分子机制,为TSSC3作为骨肉瘤分子靶点提供更多理论依据。有鉴于此,本研究共分三个部分。第一部分明确TSSC3表达在骨肉瘤细胞系及骨肉瘤组织中与自噬的相关性,并初步探讨TSSC3诱导自噬的相关分子机制。第二部分探讨自噬流水平在TSSC3对骨肉瘤细胞恶性表型抑制中所起到的重要作用。第三部分探索TSSC3和自噬相关蛋白P62、ATG5的表达与骨肉瘤患者临床相关系数和预后的相关性。主要研究方法:1)shRNA ATG5和OverTSSC3慢病毒转染构建差异表达TSSC3,ATG5骨肉瘤细胞株;2)RT-qPCR和WB验证处理诱导下转染效果、自噬水平和通路蛋白变化;3)透射电镜,荧光,WB验证差异表达TSSC3情况下自噬体合成情况;4)自噬流阻滞剂CQ应用,WB验证TSSC3对自噬影响;5)Src,Akt抑制剂和激活剂应用,WB验证Src,PI3K/Akt/mTOR通路在TSSC3诱导骨肉瘤细胞自噬中的作用;6)CCK-8,EDU,平板克隆实验验证自噬在TSSC3诱导骨肉瘤体外增殖抑制中的作用;7)裸鼠皮下成瘤验证自噬在TSSC3抑制骨肉瘤细胞体内成瘤的作用;8)划痕实验和Transwell实验验证自噬在TSSC3抑制骨肉瘤体外迁移、侵袭的能力;9)小鼠尾静脉肺转移模型验证自噬在TSSC3诱导骨肉瘤细胞体内转移的作用;10)免疫组化验证人体和裸鼠组织中靶蛋白表达变化;11)组织标本与临床参数收集,单、多因素回归分析预后相关因素;12)流式和Hoechst染色等方法验证TSSC3诱导自噬与凋亡相关性。主要研究结果如下:1.TSSC3过表达增强骨肉瘤细胞自噬流1.1在MTF和SaOS2两个骨肉瘤细胞系中利用慢病毒转染获得稳定过表达TSSC3细胞株后发现,过表达TSSC3的MTF与SaOS2细胞中,自噬小体和自噬溶酶体明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),自噬相关基因ATG5,BECN1的mRNA和蛋白水平明显增加,LC3Ⅱ表达增加,P62表达减少。1.2利用自噬晚期阻断剂CQ,发现在两种过表达TSSC3的骨肉瘤细胞中,联合氯喹后,P62和LC3Ⅱ蛋白水平明显增加,提示自噬流通畅,过表达TSSC3增强骨肉瘤自噬流而不是阻滞自噬。2.TSSC3,ATG5蛋白水平在骨肉瘤组织中存在正相关性2.1 TSSC3和ATG5在良性骨肿瘤(21例纤维结构不良和12例骨母细胞瘤)中阳性率明显高于骨肉瘤(58例),P<0.05;P62在良性骨肿瘤中的阳性率低于骨肉瘤,但差异无统计学意义,P>0.05。2.2 TSSC3与ATG5在骨肉瘤组织标本中蛋白表达存在中等程度正相关,P=0.003,R=0.395;而与P62无明显相关性,P>0.05。3.Src依赖的PI3K/Akt/mTOR通路介导了TSSC3促进骨肉瘤细胞自噬的作用3.1 p-Src、p-Akt和p-mTOR的表达在过表达TSSC3的MTF和SaOS2细胞中较对照组明显降低。3.2应用Src激动剂p-YEEI可以明显增加p-Src、p-Akt、p-mTOR的表达,并抑制过表达TSSC3诱导的骨肉瘤自噬。3.3应用Akt激动剂IGF1不增加p-Src表达,但可以明显增加pAkt和p-mTOR表达,并抑制过表达TSSC3诱导的骨肉瘤自噬。3.4联合利用Src通路激活剂p-YEEI和PI3K抑制剂BEZ235对过表达TSSC3的骨肉瘤细胞进行同时处理,发现单纯Src激活不伴Akt/mTOR通路激活无法抑制TSSC3诱导的骨肉瘤细胞自噬。4.自噬介导TSSC3对骨肉瘤细胞的成瘤抑制。4.1在MTF和SaOS2细胞中,过表达TSSC3明显抑制骨肉瘤的增殖能力,通过CQ抑制TSSC3增强的骨肉瘤细胞自噬流后,CCK-8,平板克隆和EDU增殖实验显示,TSSC3对骨肉瘤细胞体外增殖能力的抑制减弱(P<0.05)。采用敲低ATG5的方法抑制自噬体形成后,TSSC3对骨肉瘤的增殖抑制能力也明显减弱(P<0.05)。4.2通过Hoechst和流式检测(PE/7-ADD)发现过表达TSSC3明显增加MTF和SaOS2两种骨肉瘤细胞的凋亡率,而通过CQ抑制自噬后overTSSC3的SaOS2凋亡率明显减少(P<0.05),但对overTSSC3 MTF细胞凋亡率无显著影响(P>0.05)。4.3过表达TSSC3明显减少MTF细胞的裸鼠皮下成瘤体积和生长速率,Ki67指数减少(P<0.05),共转染TSSC3过表达和ATG5敲低后,MTF细胞体内成瘤能力较TSSC3过表达组明显增加,Ki67指数增加(P<0.05)(自噬水平由组织透射电镜和IHC检测自噬相关蛋白表达水平进一步确认)。5.自噬介导TSSC3抑制骨肉瘤侵袭、转移的作用5.1在过表达TSSC3的细胞系中细胞迁移和侵袭能力明显降低,伴随着CQ或者敲低ATG5的应用抑制自噬后,骨肉瘤细胞的体外侵袭、迁移能力部分回复(P<0.05)。5.2检测上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达情况,发现过表达TSSC3后可以抑制MTF、SaOS2间充质相关标记蛋白N-cadherin、Vimentin、MMP2的表达,增加SaOS2细胞上皮相关标记蛋白E-cadherin的表达。在此基础上利用CQ或敲低ATG5来抑制自噬可以抑制TSSC3引起的骨肉瘤上皮-间质样转化过程。裸鼠移植瘤IHC结果显示体内实验抑制自噬会增加过表达TSSC3 MTF细胞产生移植瘤中Vimentin蛋白表达,减少Ecadherin蛋白表达。5.3裸鼠尾静脉模型显示过表达TSSC3不能在敲低ATG5的MTF细胞中有效抑制其肺转移能力,过表达TSSC3同时敲低ATG5的MTF细胞导致裸鼠肺转移率和瘤结节数明显高于过表达TSSC3组,而生存时间短(P<0.05),与对照组无明显差异(P>0.05)。6.TSSC3、P62和ATG5表达与骨肉瘤患者临床病理参数和预后的关系6.1在临床组织标本上TSSC3蛋白表达水平与与骨肉瘤患者复发率呈负相关(P<0.05),而P62和ATG5与骨肉瘤患者临床病理学参数无明显相关(P>0.05)。6.2 TSSC3阳性表达与骨肉瘤患者较好总生存预后有正相关(P<0.05),而ATG5和P62表达与骨肉瘤患者预后没有统计学差异的直接联系,P>0.05。但在TSSC3阳性的骨肉瘤患者中,ATG5阳性患者有较好预后,P<0.05。6.3 COX多因素回归分析发现TSSC3蛋白表达,肿瘤长径大于8cm和转移是骨肉瘤患者预后的独立危险因素(P<0.05)。综上所述,本文主要结论如下:过表达TSSC3通过抑制Src依赖的PI3K/Akt/mTOR通路来激活骨肉瘤细胞自噬流,并通过自噬抑制骨肉瘤体内外成瘤、转移。ATG5和TSSC3在骨肉瘤中蛋白表达明显降低且呈正相关;TSSC3是骨肉瘤患者预后的独立危险因素,且TSSC3阳性患者中ATG5阳性的亚群临床分期更优,且预后较好,ATG5阳性可能作为TSSC3阳性骨肉瘤患者的良性预后分子靶标。