棉花抗虫相关基因GhJMTs的克隆及功能鉴定

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茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)是广泛存在于植物中的植物激素,在调节植物生长、生殖发育以及植物防御害虫等生命活动中发挥着重要作用。茉莉酸转甲基酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferases,JMT)以S-腺苷-蛋氨酸(S-adenosyladenyl-L-methionine,SAM)为甲基供体,能够催化茉莉酸生成茉莉酸甲酯,属于SABATH转甲基酶家族,在植物防御中发挥着重要作用。目前,JMT基因已经在拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa和番茄Solanum lycopersicum等多种植物中被分离鉴定,但是棉花 Gossypium hirsutum 中关于 JMT 基因的研究未曾见报道。本研究克隆获得陆地棉转甲基酶基因GhJMT1和GhJMT2,并通过原核表达和体外酶促反应研究了它们的体外功能,初步探索该基因在棉花-棉铃虫Helicoverpa armigera-中红侧沟茧蜂Microplitis mediator三级营养间的作用,主要研究内容及结果如下:  1、克隆获得棉花茉莉酸转甲基酶基因 GhJMT1和GhJMT2 的 ORF 全长序列, GhJMT1(GenBank KY605041)和GhJMT2(GenBank KY605042)的ORF分别为1116 bp和1119 bp,编码371和372个氨基酸,分子量为41.5和41.7 kDa,等电点为5.83和5.96。氨基酸序列分析显示 GhJMT1和GhJMT2 均不含信号肽序列,且没有跨膜区。GhJMT1和GhJMT2具有JMT家族典型的保守序列,与其它植物的JMT具有较高的一致性。其中,GhJMT1与草莓、拟南芥和毛果杨中JMT的一致性分别为58.9%、57.1%和65.5%,GhJMT2与草莓、拟南芥和毛果杨中JMT的一致性分别为57.6%、54.9%和64.6%。另外,GhJMT1与GhJMT2的一致性高达72.7%。  2、通过原核表达获得GhJMT1和GhJMT2编码的可溶性重组蛋白。运用气相色谱与质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)技术进行体外酶活性检测。结果显示GhJMT1和GhJMT2在SAM作为甲基供体的条件下,均能催化底物JA生成MeJA,但不能催化底物水杨酸、4-羟基-苯甲酸和肉桂酸。  3、通过动态顶空法收集MeJA和水杨酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)诱导后的棉花挥发物,通过GC-MS对挥发物进行定性和定量分析。MeJA诱导棉花释放21种挥发物,其中,2种诱导型化合物的含量显著增加,12种新形成型化合物重新合成;MeSA诱导棉花挥发物释放量相对较少,为12种,其中3种化合物重新合成。  4、采用荧光定量qPCR技术分析了棉花GhJMT1和GhJMT2在棉铃虫幼虫取食前后表达水平的差异。结果显示棉铃虫取食6 h后GhJMT1和GhJMT2的表达量均显著上调,表明棉铃虫取食诱导GhJMT1和GhJMT2参与了棉铃虫取食诱导的防御反应。但是取食后,GhJMT1的相对表达量高于GhJMT2,说明这两个基因在棉花体内的调控机制可能存在着差异。另外,激素处理后 GhJMT1和GhJMT2 表达结果显示,MeJA 诱导GhJMT1在叶和茎中上调表达,GhJMT2只在叶中上调表达,且GhJMT1和GhJMT2不被MeSA所诱导。  5、采用触角电位技术研究了棉铃虫及其天敌中红侧沟茧蜂对 MeJA 标准品以及MeJA诱导棉花挥发物的触角电位反应。结果表明,棉铃虫及中红侧沟茧蜂对MeJA、β-罗勒烯、(Z)-3-己烯基乙酸酯和芳樟醇有强烈的电生理反应。其中,中红侧沟茧蜂雌、雄蜂触角对MeJA的反应存在显著差异,其中雌蜂触角对MeJA有较高反应值,据此推断MeJA在雌成蜂寄主定位活动中发挥重要作用。
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