千金藤碱对人鼻咽癌细胞CNE--2和5--8F的作用及机制研究

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目的:研究千金藤碱是否能抑制人鼻咽癌CNE-2、5-8F细胞的生长,此作用是否有浓度、时间依赖性,并探索其作用机制。  方法:(1)采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测千金藤碱对CNE-2、5-8F细胞的细胞毒性作用:不同浓度的千金藤碱(1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)以不同时间(24h、48h、72h)作用于CNE-2和5-8F细胞后,用酶标仪测定吸光度,计算千金藤碱对细胞的抑制率,并制作抑制率曲线图;(2)采用流式细胞仪(FCM)检测CNE-2、5-8F细胞的细胞周期及凋亡率:根据CCK-8的实验结果选择适当的药物浓度,作用于CNE-2和5-8F细胞48h后,上机检测;(3)采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测周期、凋亡相关蛋白的mRNA表达:根据CCK-8的实验结果,选择半数抑制浓度(IC50浓度)为中浓度,设置低、中、高三个浓度的千金藤碱处理组,分别作用于CNE-2、5-8F细胞24h、48h、72h后,检测三组中各基因的mRNA表达量;(4)采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Bcl-2、Bax、Cyclin D1的蛋白表达量。  结果:(1)CCK-8检测结果表明:CNE-2细胞经千金藤碱作用24h、48h、72h后的半数抑制浓度(IC50值)分别为16.0737mg/L、9.8561mg/L、5.61277mg/L;5-8F经千金藤碱作用24h、48h、72h后的IC50分别为27.5491mg/L、19.5802mg/L、10.9068mg/L,各组间差异显著(P<0.05),并呈现时间和浓度依赖性;(2)FCM周期检测结果:当药物浓度从0mg/L增加到20mg/L时,CNE-2的G2期细胞比例从0mg/L浓度时的14.20±0.23增加到20mg/L浓度时的64.86±0.29,5-8F的G2期细胞比例从0mg/L浓度时的10.31±1.25增加到20mg/L浓度时的53.90±1.43,相比对照组差异显著(P<0.01);FCM凋亡结果显示:随着药物浓度增加,CNE-2细胞凋亡率从0mgL的6.26±0.33增加到20mg/L的39.79±1.78,相比对照组差异显著(P<0.01)。随着药物浓度增加,5-8F细胞凋亡率从0mg/L的5.12±0.30增加到20mg/L的33.07±0.72,相比对照组差异显著(P<0.01)。(3)qRT-PCR法检测结果显示,在两株细胞中Bcl-2和Cyclin D1的mRNA表达量随着药物浓度增加及作用时间的延长而逐渐减少,Bax的mRNA表达量随着药物浓度增加及作用时间的延长而逐渐增加;(4)Western blot法检测结果显示,两株细胞中Bcl-2和Cyclin D1的蛋白表达量随着药物浓度增加及作用时间延长而逐渐减少,Bax的蛋白表达量随着药物浓度增加及作用时间延长而逐渐增加。  结论:(1)千金藤碱对人鼻咽癌CNE-2和5-8F细胞有增殖抑制作用,能够阻滞细胞周期于G2期,并诱导CNE-2和5-8F细胞的凋亡;(2)千金藤碱可能是通过下调CNE-2和5-8F细胞中Bcl-2和Cyclin D1的表达,上调Bax的表达影响细胞周期,并诱导凋亡。
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