肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,每年约有40-50万新发病例。我国肝癌的死亡率仅次于胃癌和食道癌位于第三位,每年约有10万人死于该病。HCC多见于青壮年男性,经诊断后平均存活期约为6个月。尽管近年来早期肝癌发现率的提高以及治疗技术的进步使肝癌的死亡率有所降低,但由于HCC复发率高,容易发生肝内及肝外转移,常规放化疗效果不佳,故HCC病人总体预后不良。HCC的复发和高死亡率与肿瘤细胞快速增殖、多结节生长,血管侵润,易血道转移等诸多因素相关,因此,对HCC发生、发展的分子机制的进一步研究将利于寻求分子靶标并探索新的治疗方法。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)最初是作为激活的淋巴细胞产生的一种可溶性淋巴因子被发现。其具有抑制巨噬细胞移走﹑粘俯和吞噬的功能。近来的研究表明,MIF在多种肿瘤细胞中过度表达,提示MIF与肿瘤的发生关系密切。多项研究发现,MIF参与了HCC发生和发展。随着后基因组时代的到来,越来越多基因的功能被揭示,许多与疾病相关的基因及治疗的有效靶点被确认。利用RNA干涉技术沉默致病基因,可实现快速、高效、特异的基因治疗。有文献报道应用siRNA阻断Survivin、Cyclin E的表达可抑制肝癌细胞增殖。关于应用siRNA阻断MIF表达来研究MIF控制HCC发生和发展的机制,至今为止尚未见另有文献报道。本研究以免疫组织化学研究HCC组织中MIF和cyclinD1的表达及其与临床病理特征的关系为基础,进一步应用RNA干扰技术,化学合成与MIF mRNA匹配的双链小干扰RNA(siRNA),转染HCC细胞系,特异地阻断或抑制MIF表达。用免疫印迹方法和免疫荧光检测MIF表达及有关细胞增殖及存活信号分子MAPK/ERK﹑ AKT、GSK3β、CyclinD1和Cdk4/6等的表达;定量RT-PCR检测MIF和cyclinD1 mRNA变化;细胞增殖和迁移实验观测肝癌细胞行为学的改变;接种MIF siRNA和对照siRNA转染的HCC细胞于裸鼠皮下,观察比较皮下肿瘤生长的体积。通过探讨肝癌细胞自分泌MIF参于控制癌细胞增殖﹑迁移以及血管生成的分子机制,我们期望通过利用特异的siRNA阻断MIF表达从而抑制肝癌细胞生长和转移,揭示其相关机制并为临床治疗HCC和开发新一类抗肿瘤药物提供有价值的实验依据。第一部分巨噬细胞移动抑制因子和细胞周期蛋白D1在肝细胞肝癌中的表达目的研究MIF、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在HCC组织中的表达及其可能的关系。方法应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测93例HCC中MIF、CyclinD1的表达,分析它们的表达与HCC临床病理特征的关系。应用定量PCR及Western blot技术检测MIF和Cyclin D1mRNA和蛋白观察10例新鲜肝癌组织和癌旁组织的表达差异。结果免疫组化结果表明,组织芯片93例HCC中MIF、CyclinD1表达率分别为71%、41%。MIF和CyclinD1阳性表达率与正常肝脏组织(均为阴性)表达率之间的差异有统计学意义(P<0.01)。在≥3.5cm的肿瘤中MIF表达率为79%,明显高于在小于3.5cm肿瘤中的表达率48%(P<0.01);有转移的肝癌组织中CyclinD1阳性率62%,明显高于无转移病例中阳性率35%,差异有统计学意义(P<0.05)。MIF表达强弱与CyclinD1明显正相关(P<0.01)。MIF和Cyclin D1 mRNA在肝癌组织中的相对表达量为癌旁组织的7.31±1.85倍和4.27±1.05倍,差异均具有统计学意义(FMIF=111.4, P<0.01;FCyclinD1=58.4,P<0.01)。MIF和CyclinD1蛋白在肝癌组织中的表达量明显高于与癌旁组织,MIF和CyclinD1蛋白在肝癌组织中的表达分别比癌旁组织高3.6±0.80倍和2.3±0.10倍(FMIF=15.5 ,P<0.01;FCyclinD1=87.5,P<0.01)。结论MIF和CyclinD1蛋白及其mRNA在HCC中高表达。MIF的表达与CyclinD1的表达呈正相关关系,提示MIF、CyclinD1在HCC发展进程中可能起共同促进癌细胞生长和转移的作用。第二部分小RNA干扰MIF基因表达抑制肝癌细胞增殖、迁移和生长目的研究特异性小干扰RNA(MIF siRNA)对肝癌细胞MIF基因表达的抑制作用,以及MIF基因表达下降对肝癌细胞增殖和迁移的影响。方法脂质体方法将化学合成的MIF siRNA转染肝癌细胞PLC、HepG2。定量RT-PCR、Western blot检测MIF mRNA和蛋白的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、体外细胞侵袭实验检测细胞增殖和对重组基底膜(matrigel)穿透能力。裸鼠皮下种植siRNA转染的肝癌细胞PLC,观察肿瘤结节形成和增长情况至术后第20天。结果50 nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2细胞的MIF mRNA表达下调60.6%和72.1%,蛋白水平降低59.74%和64.84%。100 nmol/L的MIF siRNA使PLC和HepG2细胞的MIF mRNA表达下调81.3%和89.1%,蛋白水平降低69.50%、72.31%,与对照组相比较其差异有统计学意义(p均<0.01)。100 nmol/L MIF siRNA转染24hr后PLC和HepG2细胞MIF免疫荧光明显减弱,MIF表达水平明显下降;细胞增殖率分别下降16.79%和47.14%(p均<0.05)。穿透matrigel的细胞数与对照组比较分别下降41.38%和40.63%,差异有统计学意义(p均<0.05)。实验组裸鼠肿瘤明显比对照组生长缓慢,第7起发现肿瘤大小差异有统计学意义。结论MIF siRNA能有效抑制MIF表达及肝癌细胞增殖、迁移和生长。第三部分siRNA阻断MIF表达抑制肝癌增殖和迁移的分子机制目的研究探讨特异性MIF siRNA抑制细胞肝癌细胞增殖和迁移的可能作用机制。方法化学合成与MIF mRNA匹配的siRNA双链,脂质体方法转染人肝癌细胞PLC、HepG2等。realtime-PCR检测CyclinD1mRNA水平和MIFmRNA水平的变化趋势。Western blot检测ERK、AKT、GSK3β信号传导通路和CyclinD1、CDK4、CDK6以及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)等相关的分子表达的改变。免疫印迹验证4对HCC癌组织和癌旁组织的磷酸化ERK(p-ERK)水平结果MIF siRNA转染PLC和HepG2细胞24小时后,CyclinD1mRNA水平伴随MIFmRNA水平的下降而下调,western blot结果提示CyclinD1在MIF siRNA转染浓终度为100nM时表达下调69.4% 81.7%。100nM MIF siRNA转染PLC和HepG2肝癌细胞后磷酸化ERK、AKT水平下降,磷酸化GSK3β水平上升,MMP2水平下降。MIFsiRNA干扰PLC和HepG2后Western blot检测CDK4、CDK6表达未见明显变化。结论化学合成的MIF siRNA有效阻断MIF的表达并抑制肝癌细胞增殖和迁移,MIF可能通过激活ERK、AKT信号通路和wnt通路的GSK3β调节CyclinD1分子的表达,同时调节MMP-2表达,促进肿瘤细胞的增殖和迁移。