膜活性多肽HPRP-A1是一种α-螺旋型阳离子多肽,具有良好的抗菌抗癌活性,本研究在前期工作基础上,通过碱性氨基酸的定点取代和螺旋卷曲结构的改造,研究膜活性多肽的构效关系,本论文主要包括两部分的内容。其一,由于大多数的膜活性多肽都富含带正电荷的氨基酸,我们用不同数目精氨酸取代亲本肽中的赖氨酸,以探究碱性氨基酸对于膜活性多肽活性的影响。首先,通过反向高效液相色谱(RP-HPLC)对改造前后多肽的疏水性及自聚集能力进行测定,证实疏水性与其精氨酸的含量基本呈现正相关,而与多肽的自聚集能力呈负相关;其次,通过抑菌实验、MTT实验、溶血实验探究碱性氨基酸取代与多肽生物活性之间的关系,证实精氨酸含量的增加,部分增强了抗菌肽对于He La细胞的抗癌活性,但在一定程度上不仅降低了其抗菌活性,还增强了多肽的溶血活性;最后,NPN、ONPG实验证实多肽对细菌细胞外膜和内膜的穿透性随着精氨酸取代数目的增加而减弱,而脂质体模拟膜及色氨酸荧光淬灭实验,也进一步证实上述结论。本设计未改变多肽序列中净电荷的数目和疏水氨基酸的组成,随着精氨酸含量的增加,尽管多肽的疏水性和螺旋度得到了增强,但多肽对细菌细胞膜的穿透能力下降,进而导致抗菌活性降低。我们推测这与精氨酸与磷脂具有较强的结合能力有关,与赖氨酸的伯胺相比,精氨酸的胍基对细菌细胞膜的结合能力更强,使其穿透能力下降。这与膜渗透性实验结果相符,也进一步证实了α-螺旋型抗菌肽的抗菌活性与多肽的自聚集能力相关。其二,α-螺旋型多肽中的重复七肽序列称作卷曲螺旋,包含七个位点,其中A位与D位通常为疏水性氨基酸,形成非极性面,E位与G位的带电荷氨基酸可形成螺旋间的离子对,相反电荷相互间的作用对该结构的稳定有益,反之,同种电荷间的排斥作用不利于其稳定性。我们取代了重复七肽序列所形成的螺旋卷曲的A位或D位的氨基酸,但未改变多肽序列中的氨基酸组成,以探究HPRPA1中螺旋卷曲结构对其活性的影响。首先,通过RP-HPLC进行多肽疏水性的测定,通过抑菌实验、MTT实验、溶血实验,探究取代与抗菌肽生物活性之间的关系,证实多肽疏水性、卷曲螺旋的稳定性与抗菌抗癌活性成正相关;其次,通过LDH、细胞凋亡等试验测定其抗癌机理,证实亲本肽及改造后的多肽通过破坏细胞膜的方式进入He La细胞,无胞吞作用方式,且在一定程度上均可通过线粒体介导的内源途径诱导癌细胞凋亡;最后,通过NPN、ONPG试验测定多肽对细菌细胞外膜和内膜的穿透性,证实多肽对细菌细胞内、外膜均具有破坏作用,脂质体模拟试验也进一步说明多肽对于磷脂双层膜的破坏作用并表现出与生物活性相同的趋势。不能形成卷曲螺旋的HPRP-A1-L6K7疏水性明显降低,细菌模拟膜的破坏能力随之显著减弱,亲本肽及衍生肽HPRP-A1-L15K7因在A位与D位存在的亮氨酸形成两对拉链结构,具有较强的破膜能力。而同样形成两对拉链结构的HPRP-A1-K8L15,因其疏水性降低,破膜能力也随之减弱。这进一步说明,抗菌肽活性发挥过程中,除了疏水性的作用,肽链间形成的卷曲螺旋结构也对其活性具有一定的影响。