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研究背景和目的:乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）同肝细胞慢性炎症发生发展的确切关系尚不清楚。课题组前期研究发现,HBx可直接与线粒体呼吸链蛋白细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ（cytochrome c oxidase subunitⅢ,COXⅢ）结合并促进氧化应激诱导的线粒体损伤及胞浆活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白（NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3）炎症小体的激活在肝脏慢性炎症、肝纤维化、肝硬化等多种肝脏疾病的发生发展中发挥重要作用。线粒体ROS模型是NLRP3炎症小体激活途径之一。HBx与线粒体COXⅢ结合后可能通过线粒体ROS模型激活NLRP3炎症小体,促进炎症因子凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白介素18（interleukin-18,IL-18）和高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）释放,并诱导肝细胞焦亡（pyroptosis）。本项目将以前期研究结果为基础,探讨氧化应激环境下,HBx对HL7702肝细胞线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species,mitoROS）、NLRP3炎症小体和细胞焦亡的影响,并使用ROS清除剂（N-acetyl-L-cysteine,NAC）进行验证,进一步探讨氧化应激环境下,HBx介导肝细胞炎性损伤的具体机制。研究方法:首先,应用Western blot验证pcDNA3.1（pNC）,pcDNA3.1-HBx（p HBx）,pGEM-4Z（pGEM）,pGEM-HBV-?HBx（pHBV-HBx）和pGEM-HBV（pHBV）各质粒的表达情况;CCK-8确定H2O2诱导肝细胞氧化应激的最佳干预浓度;ELISA检测氧化应激环境下HBx对肝细胞炎症因子ASC、IL-1β、IL-18和HMGB1表达的影响。其后,应用qPCR和Western blot检测HBx对NLRP3炎性小体组分的表达及活化的影响;PI与Hoechst 3342双染和透射电镜观察肝细胞膜孔形成,并检测细胞上清LDH含量进一步验证膜孔形成;线粒体蛋白质抽提结合Western blot检测HBx的线粒体定位;MitoSOXTM Red线粒体超氧化物指示剂染色结合流式细胞术检测mitoROS水平;ROS清除剂NAC干预后进一步验证上述改变。最后,应用免疫组织化学染色检测不同HBV DNA载量的病人肝组织NLRP3、ASC以及IL-1β表达情况,并分析HBV DNA含量与上述指标的相关性;ELISA检测HBV感染者与未感染者血清中ASC表达情况。研究结果:氧化应激环境下,HBx促进HL7702肝细胞炎症因子ASC、IL-1β、IL-18和HMGB1的释放;HBx可上调并激活NLRP3炎性小体和诱导肝细胞焦亡,进而促进上述促炎因子的产生;HBx定位于线粒体,并诱导线粒体肿胀和mitoROS升高;ROS清除剂NAC干预可部分抑制HBx诱导的NLRP3炎性小体激活和肝细胞焦亡;病人肝组织NLRP3、ASC和IL-1β的表达水平与HBV DNA的载量呈正相关;与HBV阴性的患者相比,HBV病人血清ASC的表达水平更高。结论:氧化应激环境下,HBx可通过mitoROS途径激活NLRP3炎性小体,促进肝细胞炎症因子ASC,IL-1β,IL-18和HMGB1的释放以及肝细胞焦亡。