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近年来,我国的水产养殖量跃居世界前列,占到了全球养殖的70%。但是,随着水产养殖业规模的不断扩大,病害问题也频繁爆发,主要防治手段就是使用化学药物和抗生素,最终导致耐药病原菌增多、环境污染加剧和生态风险升高等一系列问题。抗菌肽是生物体合成的一类小分子防御多肽,是免疫防御系统在诱导条件下产生的一类防御性肽类活性物质,用于消灭外源性病原体,具有活性高、特异性强和广谱杀菌等特点,同时能够中和内毒素、增强机体免疫力,是最有可能替代抗生素成为新型的抗菌药物。本文以斑节对虾为材料,通过转录组测序的方式,获得一些新型的抗菌肽,并对它们进行生物信息学分析;采用原核表达系统表达抗菌肽,利用亲和层析技术进行分离纯化;最后对它们的功能和活性进行研究,主要研究内容和结果如下:(1)副溶血弧菌胁迫3h可促进斑节对虾的抗菌肽表达,6h导致斑节对虾死亡。斑节对虾经浓度为1×10~7CFU/mL的副溶血弧菌胁迫3h后,提取其肝胰腺的总RNA进行转录组测序;(2)转录组测序获得27.91Gb的数据和40040个unigene,平均长度为1104bp。对unigene进行注释并富集,GO富集结果显示有103个与免疫和病毒有关的基因,KOG富集结果显示255个与防御机制相关的基因,KEGG富集结果显示5399个与疾病相关的基因。通过与抗菌肽数据库比对后获得9个新的抗菌肽基因,其中有4个属于ALFs家族、3个属于Crustin家族和2个属于lysozyme家族;对这些抗菌肽进行生物信息学分析并分别命名为ALFPm9、ALFPm10、ALFPm11、ALFPm12、CarcininPm1、CarcininPm3、CrsutinPm11、Pmlyzi3和Pmlyzi4;(3)对以上抗菌肽进行同源性分析和结构预测,结果显示4个ALF都含有一个由22个氨基酸残基组成的LBD功能区,3个Crustin都含有一个富含半胱氨酸区域和WAP结合域,2个lysozyme都含有一个富含半胱氨酸的LYZ1结构域。同源性分析结果显示4个ALFs、2个Crustin和2个lysozyme均能找到与它们同源关系相近的序列,而CarcininPm3没有发现同源关系相近的序列;(4)利用SUMO融合技术,对这些抗菌肽进行原核表达,结果显示除了ALFPm9外,均能成功获得可溶性表达,并获得这些抗菌肽最佳诱导时间和IPTG浓度。通过亲和层析技术分离纯化,能够获得纯度较高的抗菌肽,蛋白浓度最高可达560μg/mL;利用SUMO酶切除SUMO融合标签,结果显示在4℃、1个酶活单位的SUMO酶处理16h后,能够切割100μg的目的蛋白,液相色谱质谱联动仪(LC-MS)鉴定切除融合标签后的抗菌肽为目的蛋白;(5)最后,我们对抗菌肽ALFPm10的抑菌活性和机理进行了初步的研究。采用OD法分析抑菌活性,结果显示:ALFPm10在浓度为12μM时对Bacillus sp.T2、Aeromonas hydrophila和Vibrio Parahaemolyticu均有明显抑制作用。ALFPm10对Aeromonas hydrophila的最小抑菌浓度为6μM,且随浓度增加抑菌效果更好。利用扫描电子显微镜研究重组抗菌肽ALFPm10对Bacillus sp.T2的作用,结果表明ALFPm10可使Bacillus sp.T2的菌体破裂,内容物释放,细胞形态严重改变。综上所述,本实验从斑节对虾中筛选出具有抑菌活性的抗菌肽,可在较低浓度抑制副溶血弧菌等水产养殖的致病菌,有望用于水产养殖业和食品保鲜行业,从而实现绿色养殖。