肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重实时PCR法的建立

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食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因,对人类健康危害很大,其中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是两种常见的致病菌。单增李斯特菌可引起败血症、脑炎、脑膜炎、脓肿及孕妇流产等一系列食源性李斯特菌病,病死率高达30%~70%。由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖,故其危害性进一步增大。金黄色葡萄球菌是引起食源性葡萄球菌病最常见种类,可引起呕吐、腹泻等临床症状。两种菌在自然界均广泛存在,人们食用的肉、奶、蛋、水产品和蔬菜常受到这两种菌不同程度的污染,其中以肉和肉制品污染最为严重。因此,建立肉中这两种致病菌的快速、可靠的检测方法具有重要的实际意义。荧光定量PCR技术融汇了PCR的高效扩增、核酸探针杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确性定量的优点。根据荧光定量PCR仪多通道的激发光源,可达到同时检测多种细菌的目的。目前为止还未见运用荧光定量PCR技术同时检测肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的报道,故本试验对肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法进行研究,以期能够快速、准确的检测肉中这两种致病菌,从而达到预防和控制由这两种菌引起的疾病的目的。以单增李斯特菌hlyA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,分别设计一对引物和一条‘TaqMan探针,在构建阳性重组质粒的基础上,分别建立基于TaqMan探针的检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的单一荧光定量PCR方法,并分析其特异性、敏感性和重复性。特异性结果显示,对于单增李斯特菌荧光定量PCR方法,10株单增李斯特菌均产生S型扩增曲线,其它6株非单增李斯特菌均不产生扩增曲线;对于金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,5株金黄色葡萄球菌均产生S型扩增曲线,其它6株非金黄色葡萄球菌均不产生扩增曲线。敏感性结果显示,建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的标准曲线相关系数分别为0.998(R2=0.998)和0.997(R2=0.997),敏感性分别为39和37.4拷贝数。重复性试验结果显示,建立的单增李斯特菌荧光定量PCR方法和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法组内变异系数均小于1%,组间变异系数均小于2%。在单一荧光定量PCR方法的基础上,建立单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法,分析两者的交叉反应,并制作标准曲线分析方法的敏感性。结果表明,单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌两者在建立的双重荧光定量PCR方法中互不影响各自的扩增效率,两条标准曲线相关系数均在0.99以上,该法检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的敏感性分别为19.5拷贝/μL和18.7拷贝/μL。将建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法应用到人工模拟肉样的检测,确定这两种致病菌在人工模拟肉样中的最低检测限,建立肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的肉中这两种致病菌的双重荧光定量PCR方法的标准曲线在106~101cfu/mL范围内相关性良好,最低检测限均为10cfu/mL。包括基因组提取在内的整个检测过程只需约3个小时,建立的方法可用于肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同步、快速、定量、准确、敏感检测。采用建立的肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法对哈尔滨100份市售生肉样品进行单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测,并与传统培养法进行比较。结果表明,荧光定量PCR法对单增李斯特菌的检出率为7%,对金黄色葡萄球菌的检出率为6%,高于传统培养法对单增李斯特菌3%的检出率和对金黄色葡萄球菌3%的检出率。
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