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背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，其感染仍是世界范围内慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因，严重危害人类健康[1]，而治疗慢性乙型肝炎的首要目标是持久抑制病毒的复制。阿德福韦酯（Adefovir，ADV）是目前被批准治疗慢性乙型肝炎的一种核苷类似物药物，通过抑制HBV聚合酶（HBV Polymerase，HBV-Pol）的活性来抑制病毒复制，但是长期治疗会发生耐药导致治疗失败[2]。HBV聚合酶主要分成四个结构域：N末端蛋白区（TP），间隔区（SD），逆转录酶区（Reverse Transcriptase，RT），核糖核酸酶（RNaseH）区~[3]。该蛋白同时具有DNA聚合酶和RNaseH酶活性，直接参与了HBV基因组的复制。HBV繁殖速度快，但其DNA聚合酶缺乏纠错能力，复制过程中有大量突变发生，使得药物与HBV聚合酶的亲和力下降，进而导致药物抑制病毒复制的作用明显减弱[4,5]，其中HBV聚合酶RT区域的rtN236T和rtAl81T/V变异是与阿德福韦耐药有关的常见变异位点[6,7]。临床研究发现，一些患者在长期使用同一种抗病毒药物治疗过程中会发生病毒载量的―反跳‖，先前的药物已经不能抑制病毒的复制。可见先前用药造成的突变能改变后续的治疗方案和治疗效果。因此开展对HBV聚合酶RT区域功能的研究和对ADV等核苷类似物引起的耐药进行实时监测尤为必要。目的本课题一方面拟通过表达纯化HBV聚合酶RT区蛋白，来探索ADV抑制RT的机制；另一方面尝试建立一种快速、灵敏、特异检测ADV耐药突变株的方法，实现实时监测ADV耐药突变的发生，为后续治疗方案的调整提供依据。方法1:以临床慢性乙肝患者血清中的HBV DNA为模板，克隆HBV聚合酶RT区到原核表达载体pHis-SUMO载体上，构建了重组表达质粒SUMO－RTWT，进一步通过定点突变构建含有阿德福韦耐药突变位点(181T/V+236T)的原核表达质粒SUMO－MT1和SUMO－MT2，原核表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定，并进行原核表达条件的优化和HBV聚合酶RT区域的结构建模。2:利用反向杂交技术原理设计特异性肽核酸探针，通过氨基酸偶联在尼龙膜基质上，通过一系列优化实验，包括探针浓度，杂交条件，洗脱条件等进行优化，筛选出最佳反应条件，能特异性检测常见的ADV耐药突变位点；利用构建的含有ADV耐药位点的标准质粒株完成方法学评价，同时通过临床样本对检测指标（灵敏度、准确性和精确度）的评价。结果通过分子克隆的技术，成功克隆、表达三种融合蛋白、纯化得到其中一种蛋白，western blot验证蛋白的表达伴随有分子伴侣GroEL的表达。由于蛋白量少且极不稳定无法完成蛋白质结晶。采用标准质粒株检测建立了肽核酸反向杂交的方案，优化了杂交条件并且完成了对含有ADV耐药位点检测的方法学评价，对临床样本的检测为后续试验。