【摘 要】
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防御假单胞菌（Pseudomonas protegens）SN15-2是一株分离自番茄根际的高效生防细菌,其定殖于植物根系,通过产生抗生素、铁载体等次级代谢物和诱导植物系统抗性等生防机制抑制植物病原微生物的生长,在农业可持续发展中具有很好的应用前景。作为活体微生物,防御假单胞菌在制剂加工与田间应用过程中易受温度、pH值、渗透压和氧化压力等多种环境因素的影响,导致活菌数减少进而影响最大生防效果的有效
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防御假单胞菌（Pseudomonas protegens）SN15-2是一株分离自番茄根际的高效生防细菌,其定殖于植物根系,通过产生抗生素、铁载体等次级代谢物和诱导植物系统抗性等生防机制抑制植物病原微生物的生长,在农业可持续发展中具有很好的应用前景。作为活体微生物,防御假单胞菌在制剂加工与田间应用过程中易受温度、pH值、渗透压和氧化压力等多种环境因素的影响,导致活菌数减少进而影响最大生防效果的有效发挥。因此,探究防御假单胞菌的抗逆性相关调控机理可有效提高存活率,为进一步应用该菌株奠定理论基础。热休克蛋白是一类与细菌抗逆能力有密切联系的高度保守蛋白质,能够维持正常细胞稳态。转录调控因子RpoS可以调控细菌进入稳定期的次级代谢物生成,在保护菌株免受外界恶劣环境胁迫的过程中发挥重要作用。本论文探究了具有生防潜力的P.protegens SN15-2中的热休克蛋白Hsp33、Hsp40及转录调控因子RpoS在生防和抗逆机制中的功能。首先,通过自杀质粒和双交换同源重组方法构建了ΔhslO、ΔdnaJ及ΔrpoS三个相关基因突变株并分析了其对P.protegens SN15-2生防功能相关表型的特性影响。结果显示:hslO基因缺失菌株在对数期的生长速率显著低于野生型菌株,而dnaJ、rpoS基因的缺失对生长没有较大影响,说明hslO基因能够调控SN15-2的生长;在生物被膜形成能力上,培养至第6 h和第24 h时的野生型是突变株ΔrpoS的1.5倍、1.31倍,且存在显著差异（P＜0.01）,而突变株ΔhslO、ΔdnaJ不存在显著差异。表明rpoS基因对SN15-2的生物膜形成存在正向调控作用;hslO基因的缺失使得SN15-2的噬铁素产量减少,而突变株ΔdnaJ、ΔrpoS的噬铁素形成能力与野生菌株相比没有较大变化;dnaJ基因的缺失削弱了菌株的运动能力,而rpoS基因的缺失使得菌株运动性增强,表明dnaJ和rpoS分别正向和反向调控SN15-2的运动能力;hslO、dnaJ及rpoS基因的单独缺失均不影响SN15-2对青枯劳尔氏菌的拮抗效果。其次分析了hslO、dnaJ及rpoS基因在P.protegens SN15-2在逆境应答中的作用。结果显示:在47℃和49℃高温处理30min下野生株的存活率是ΔhslO的1.84倍、21.27倍;冷冻处理（-20℃）和H2O2（30mM）氧化处理60min后,野生株的存活率分别达到突变株ΔrpoS的8.57倍、2.39倍;高渗胁迫（500 mM NaCI）和酸胁迫（pH=5.0）下ΔhslO、ΔdnaJ及ΔrpoS的存活率与野生株相比无显著差异。可见,hslO基因的缺失导致P.protegens SN15-2对高温的耐受能力下降,rpoS基因的缺失导致P.protegens SN15-2对低温和氧化胁迫的耐受力下降。通过高效液相色谱HPLC和qRT-PCR分析hslO、dnaJ及rpoS基因在抗生素2,4-DAPG和群体感应信号分子（Quorum sensing molecules,QSMs）合成中的作用,结果显示ΔrpoS突变株的2,4-DAPG、信号分子C8-HSL的含量以及合成相关基因表达量显著低于野生型菌株SN15-2,而hsl0、dnaJ基因的缺失对抗生素2,4-DAPG和QSMs的生物合成没有较大影响。因此RpoS可能正向调节P.protegens SN15-2中抗生素2,4-DAPG及QSMs合成基因簇的表达。综上所述,hslO基因可调控P.protegens SN15-2的噬铁素形成能力及对高温的抵御能力,热休克蛋白基因dnaJ能够影响菌株的运动性;全局调控因子rpoS不仅可以调控SN15-2的运动能力、生物膜形成能力以及对低温、氧化等逆环境的耐受性,还对抗生素2,4-DAPG和QSMs的合成具有一定的调节作用。本文分析了hslO、dnaJ及rpoS等应激胁迫基因的潜在调控机制,对进一步提高P.protegens SN15-2的生防能力和抗逆性提供了重要理论和技术支撑。
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