赤霉素作为一种重要的植物激素,参与控制多种植物发育和生理过程,最突出的生理效应是促进茎的伸长。许多研究均表明,赤霉素对甘蔗节间伸长效果明显,显著增加甘蔗产量。虽然赤霉素处理对甘蔗节间伸长的作用已经得到证实,但机理尚末清楚。　　 本研究以甘蔗(Saccharum officinarum L.)品种新台糖22号为材料,在伸长初期用200mg/L GA3进行处理,以清水作对照,探讨赤霉素处理对甘蔗节间伸长、生理、产量和品质的影响,并对赤霉素处理后的甘蔗进行差异表达分析、克隆了甘蔗赤霉素合成关键酶GA20氧化酶基因及定量PCR分析,以便为进一步了解赤霉素调控甘蔗节间伸长机理、更好地利用赤霉素调控甘蔗生长提供参考依据。主要研究结果如下:　　 1.赤霉素处理后对甘蔗伸长效应、产量及品质的影响　　 在甘蔗伸长初期,赤霉素处理显著促进了节间伸长,节间伸长效果主要集中在中部;茎径与对照差异不明显,单茎重和甘蔗产量比对照显著提高。这说明赤霉素主要通过促进甘蔗茎伸长,提高单茎重来提高产量。赤霉素处理对甘蔗品质影响的主要结果是:蔗糖分提高,还原糖分下降,重力纯度、纤维分、锤度和转光度比对照均有不同程度的提高。　　 2.赤霉素处理对甘蔗内源激素及相关酶活性的影响　　 首次深入分析了赤霉素处理对甘蔗内源激素及相关酶活性的影响,发现外源赤霉素处理后,赤霉素和IAA含量含量显著提高;ABA含量则相反,显著下降;乙烯释放量也有所下降;ZR含量没有明显变化;ABA/IAA比值显著下降;ZR/IAA和EH/IAA的比值也有所下降;而GA3/IAA的比值有所提高。赤霉素处理后,a-葡萄糖苷酶和a-甘露糖苷酶活性显著下降;POD和β-半乳糖苷酶活性也有所下降,但不显著;a-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶、过氧化氢酶活性显著提高,β-葡萄糖苷酶活性也有一定程度提高。但无论是对内源激素和酶活性的促进作用还是抑制作用主要集中在1个月左右,这与赤霉素提高甘蔗株高和节间伸长效果基本吻合。由此可以推测,外源赤霉素促进甘蔗节间的伸长可能主要通过调节ABA和赤霉素含量,其次是乙烯释放量和生长素含量,改变了促进伸长的激素与抑制伸长的激素之间的相对平衡状态;同时通过调节a-葡萄糖苷酶、a-甘露糖苷酶、a-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶和过氧化氢酶活性,其次是POD、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性,最终达到促进节间伸长的效果。　　 3.cDNA-AFLP和cDNA-SRAP分析赤霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达　　 首次采用cDNA-AFLP和cDNA-SRAP两种技术分析了赤霉素诱导甘蔗节间伸长基因表达的差异。结果表明,GA3处理和对照甘蔗幼茎中的转录组具有很大的差异。两种技术通过对回收差异片段进行反向Northern杂交验证扣除假阳性后,得到80个差异明显阳性片段。对80个差异片段进行克隆和序列分析并进行了BLAST分析,按照功能可以将获得的80条差异片段分为7类,分别为能量与代谢相关基因、未知功能蛋白、未知基因、植物抗性相关基因、细胞壁生物合成与修饰相关基因、信号传导相关基因和转录因子相关基因。　　 4.cDNA-SCoT的开发利用及差异表达分析　　 本研究首次利用cDNA-SCoT技术进行基因差异表达分析。对不同模板、引物、体系及扩增条件等进行研究的结果表明:以第二链纯化产物10×稀释液为模板,扩增35循环的效果最好。根据引物设计的原则我们又新设计了10条引物,部分引物扩增也取得了很好的效果。cDNA-SCoT这个方法具有操作简单、重复性好、假阳性低、回收差异片段成功率高等特点,对以后差异表达将起到重要作用。　　 采用cDNA-SCoT技术对赤霉素诱导甘蔗节间伸长相关基因进行差异表达分析,得到56条差异片段。对回收的差异片段进行反向Northern杂交验证扣除假阳性后,得到30个差异明显的阳性片段(ST-TDFs),它们分别代表能量与代谢相关基因(6条,占总数的20％)、未知功能蛋白(6条,占总数的20％)、未知基因(14条,占总数的46.67％)、信号传导相关基因(2条,占总数的6.67％)、转录因子相关基因(1条,占总数的3.33％)、细胞凋亡基因(1条,3.33％)。　　 5 cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT3种差异表达技术比较分析　　 本研究首次从原理、方法、扩增、回收等方面对cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT3种差异表达技术进行比较分析,指出cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT技术均是研究基因差异表达的重要方法,得到了部分相同的差异片段,大多数的差异片段各有特点。研究者可以根据不同的研究方向和目的选择自己需要的方法或不同方法结合应用,特别是不同的差异表达技术结合应用将能够获得更全面的差异片段,从而在植物基因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机理研究等方面发挥更大的作用。　　 通过对3种技术的差异片段进行克隆测序分析发现,与甘蔗节间伸长生理紧密相关的基因片段主要是过氧化物酶和过氧化氢酶(peroxin)、乙烯合成关键酶(SAMS和SAMDC)、ABA信号传递(1,3,4-trisphosphate5/6-kinase)和赤霉素受体(GID1)。这说明本研究所得到的差异片段与甘蔗节间伸长中内源激素及相关酶活性的表现是有一致的。　　 6.赤霉素受体基因GID1定量PCR分析　　 首次通过荧光定量PCR分析了3种差异表达技术所获得的甘蔗共同差异基因片段赤霉素受体基因GID1表达结果,发现末经处理(0 h)的表达量最低,赤霉素处理后表达量逐渐提高,在6 h达到最大值,虽然12 h后逐渐下降,但到48 h又明显上升,且所有处理的表达量均高于对照(0 h),说明赤霉素受体基因GID1与节间伸长呈正相关,这可能是由于体内赤霉素含量的提高影响到赤霉素的受体GID1在核内与DELLA蛋白的结合能力的结果。　　 7.甘蔗GA20氧化酶基因克隆及定量PCR分析　　 本研究首次从甘蔗中克隆到GA20氧化酶基因片段,由740碱基组成,编码246个氨基酸。与禾本科植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在80％和75％以上,特别与亲缘关系近的玉米和高粱之间的同源性高达88％,大部分区域可达完全一致。系统进化分析也表明,甘蔗GA20氧化酶最先与亲缘关系近的玉米聚类,再和高粱聚类。通过荧光定量PCR分析甘蔗GA20氧化酶基因表达情况,结果表明,未经处理(0 h)的表达量最大,赤霉素处理后表达量持续下降,在6 h达到最低值,虽然12 h后逐渐上升,但到48 h又明显下降,且所有处理的表达量均低于对照(0 h)。这可能是外施赤霉素后改变了GA响应和GA生物合成之间的关系,进而影响到早期13-羟基化途径或早期非13-羟基化途径,使得甘蔗幼茎积累较高水平的赤霉素,导致甘蔗GA20氧化酶基因表达量下降。